extraction faible qté ARN

[emma59]

Bonjour à tous!

J'ai une question pratique: je travaille sur l'extraction d'ARN sur un échantillon n'en contenant qu'une infime quantité.
J'utilise la méthode au Trizol / chloroforme et souhaite augmenter mon rendement en utilisant un carrier tel que le glycogène. L'avez vous essayé et avez vous eu de meilleurs rendements? D'autre part, l'incubation avec le Trizol et le chloroforme se fait soit à 4°C 5 et 2 min respectivement soit à RT 15 et 3 min r. Lequel de ces 2 choix est-il le plus judicieux d'après vous?
Enfin pour diminuer ma contamination au phénol (et oui malgrès l'utilisation d'une colonne silice), je souhaite faire un ou des lavages préalables supplémentaires au chloroforme mais cela ne risque -il pas de diminuer encore mon rendement?

Merci par avance pour toutes vos réponses et expériences en extraction d'ARN.

Emma
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[Squalor]

J'utilise la méthode au Trizol / chloroforme et souhaite augmenter mon rendement en utilisant un carrier tel que le glycogène. Emma

Salut ! j'utilise habituelement l'extraction phenol/chlorophorme et glycogene pour extraire les arn des mes cultures cellulaires.. et le rendement est amliore, pas de facon faramiseuse, mais il y a une difference qui justifie l'achat!


Perso pour l'imcubation avec le chloroforme je fais 8 minutes sur glace
..

POur la derniere question avec le chloroforme, la reponse est oui on en perd un peu car quand tu prends le surnageant, mais tu reprends jamais tout, sinon il y a un enorme gros risque de prendre des proteines presentes a l'interphase..

sinon tu utilises quoi comme protocol (kit, quantitee)?

Amicalement,

Greg

[Squalor]

J'utilise la méthode au Trizol / chloroforme et souhaite augmenter mon rendement en utilisant un carrier tel que le glycogène. Emma

Salut ! j'utilise habituelement l'extraction phenol/chlorophorme et glycogene pour extraire les arn des mes cultures cellulaires.. et le rendement est amliore, pas de facon faramiseuse, mais il y a une difference qui justifie l'achat!


Perso pour l'imcubation avec le chloroforme je fais 8 minutes sur glace.. (a voir selon ton protocol)

POur la derniere question avec le chloroforme, la reponse est oui on en perd un peu car quand tu prends le surnageant, tu reprends jamais tout, sinon il y a un enorme gros risque de prendre des proteines presentes a l'interphase..

sinon tu utilises quoi comme protocol (kit, quantitee)?

Amicalement,

Greg

[invite25d591f8]

Personnellement, je suis presque à la lettre le protocole de Invitrogen.

1. Décoller les cellules dans le milieu de culture.
2. Centrifuger environ 15 secondes à 12000g
3. Retirer le surnageant et ajouter 400µl de TRIzol (resuspendre rapidement à la pipette)
4. Incuber 5 min à RT
5. Ajouter 80 µl de chloroforme et agiter vigoureusement à la main pendant 15 sec.
6. Incuber 2-3 min à RT
7. Centrifuger 15 min à 4 °C -> maximum 12000g (11300 rpm)
8. Transférer 200 µl de la phase aqueuse dans nouveaux tubes (ajouter glycogène si désiré)
9. Ajouter 200 µl isopropanol (0,5 ml/ml TRIzol)
10. Incuber 10 min à RT
11. Centrifuger 10 min à 4 °C -> maximum 12000g
12. Laver avec 400 µl EtOH 75% (1ml/ml TRIzol)
13. Centrifuger 5 min à 4 °C -> maximum 7500g (9000 rpm)
14. Sécher le culot 5-10 min et resuspendre avec 10 µl H2O nanopure (RNAse free bien sûr...)
15. Conserver les échantillons à -80 °C

Moi je trouve que l'ajout de glycogène m'aide beaucoup lorsque j'extrait l'ARN de peu de cellules. Aide à précipiter puis aide énormément pour voir son culot.

Je n'ai jamais eu de problèmes de contamination de phénol donc je ne peux malheureusement t'aider sur ce point! Peut-être le mieux serait d'utiliser les colonnes conçues pour les extractions d'ARN? Dispendieuses, mais propres!

[A voir en vidéo sur Futura]

[emma59]

Bonjour!

Je vous remercie pour vos réponses.
Pour répondre à "Greg" concernant mes quantités et protocoles, je ne travaille pas sur des cellules mais sur de l'ARN circulant dans le sang d'où les faibles quantités obtenues et la fragilité des ARN. J'ai utilisé la méthode d'extraction au Trizol puis passage sur une colonne rneasy mini kit. Vu mon faible rendement en ARN et en qPCR j'essaie d'optimiser en jouant (peut être) sur les incubations dans le tampon de lyse, l'utilisation de carrier (sachant que ce dernier est susceptible d'être à l'origine de signaux non spé lors de la PCR d'après certains articles) et sur les étapes de lavage.
La DO de mes ARN me donne une forte absorbance à 230 et légère à 270: est-ce le signe d'une forte une dégradation des ARN à 230 et d'une contamination au phénol à 270?
Autre question: lors de l'étape chloroforme, pourquoi agiter fortement à la main plutôt que vortexer?
Amicalement

[Squalor]

SAlut!

Perso j'utilise 260 nm comme longueur d'onde pour quantifier (à la grosse louche) mes ARN...

230, je sais pas ce que c'est, mais en tout cas c'est pas de l'ARN

2 eme chose, perso je vortex, et plutot pas mal mes tubes avec le chlorophorme

Certes ce genre de chose n'est pas spécialement bon pour les ARN (il est possible d'avoir une légère perte de qualité), mais je pense qu'à la fin tu y gagnes parce ton chlorophorme est mieux "éparpillé" dans ton tube, et il a plus de contact entre les solutions...

Et puis par cette méthode, j'obtiens des très beaux gels d'ARN lors de mon checking!

Amicalement,


greg

[emma59]

SAlut!

Perso j'utilise 260 nm comme longueur d'onde pour quantifier (à la grosse louche) mes ARN...

230, je sais pas ce que c'est, mais en tout cas c'est pas de l'ARN

2 eme chose, perso je vortex, et plutot pas mal mes tubes avec le chlorophorme

Certes ce genre de chose n'est pas spécialement bon pour les ARN (il est possible d'avoir une légère perte de qualité), mais je pense qu'à la fin tu y gagnes parce ton chlorophorme est mieux "éparpillé" dans ton tube, et il a plus de contact entre les solutions...

Et puis par cette méthode, j'obtiens des très beaux gels d'ARN lors de mon checking!

Amicalement,


greg

Bonjour Greg!

Je me dmandais si lors de ton checking d'ARN tu faisais un gel d'agarose en milieu dénaturant ou simplement.
En ce qui me concerne je fais juste migrer mon ARN avec des tampons et une cuve RNase free mais pas d'utilisation de formamide ou chauffage. Cependant serais-ce mieix de me faire à ton avis?
Merci.
Amicalement

[Squalor]

Salut!

Moi j'utilise (tout comme toi apparement) un gel classique d'agarrose 1,5 % TAE.

Mais il est clair qu'en condition dénaturante tu risques d'avoir un meilleur signal...à ta place c'est ce que je ferais (car selon toi ça a pas l'air d'être génial " le bête" gel d'agarrose...)

Sinon tu vois quoi sur les gels d'agarrose classiques? rien? éparse?


Amicalement,

GReg

[emma59]

Hello!

Merci pour tes réponses Greg.

En déposant 1 µg d'ARN en gel 1,2 % TAE (autoclavé bien que certaines RNases soient resistantes mais je n'ai pas de DEPC) sur une cuve "décontaminée" à la soude puis au SDS puis à de l'eau autoclavée; j'obtient des bandes 28S et 18S correctes et parfois un smear de dégradation pour les prélèvements "vieillis" exprès. Cependant je n'ai pas le ratio 28S/18S proche de 2 mais plutôt proche de 1. Il faut dire que mon scan est très vieux. Pas trop de moyens au labo donc on fait avec ce qu'on a.
J'ai quand même un bruit de fond aussi . Je me demandais juste ce qu'obtenaient d'autres personnes qui font comme moi pour pouvoir remettre en question certains points au cas où.

Amicalement

[Squalor]

Salut!

Si j'ai le temps (et si tu le veux) je scanne et je t'envoie une prep d'ARN Bonne et une autre avec une degradation.

Avec ce que tu me dis, moi ca m'a l'air pas mal, il y a juste le "bruit de fond" que je n'aime pas, c'est pour cela que si tu veux je peux t'envoyer les 2 scans et tu pourras comparer

amicalement,

Greg

[emma59]

salut!

Merci pour tes réponses.
Récapitulation d'hypothèses; tu me dis si tu es d'accord: mon bruit de fond (ou plutôt smear de fond) est dû : en haut du gel à de l'ADN génomique (quoique j'utilise de la DNase) ou à de l'ARN en struct secondaire. Au milieu du gel: à de l'ARNm + bandes intenses 28S et 18 S ARNt et enfin en bas du gel: un smear plus ou moins prononcé dû à la dégradation des ARN.

Sinon je crois que la dénaturation est necessaire lors de northern mais pas pour un "checking".

J'ai récapitulé des info d'anciennes discussions. Tu en pense quoi. Tu as ces smear de fond. Il semblerait que c'est inévitable. J'ai essayé de déposer que 500 µg d'ARN pour le minimiser mais ce n'était pas terrible finalement. D'autre part as tu réeelement un rapport proche de 1,6 ou 2 pour ton ratio 28S/18S ?

Voilà c'est pour avoir ton avis . Je serais contente de pouvoir regarder tes scans mais j'espère que ça passera sur ce vieil ordi!

amicalement

[invite25d591f8]

Selon moi, c'est complètement normal de voir un "smear" de fond, quoique quand même beaucoup plus faible que les 28S/18S (d'ARNr et non d'ARNt d'ailleurs). Tu observes ainsi tous les ARNm de la cellule à des tailles différentes. Ce qui n'est pas normal, c'est d'observer une apparence de smear qui débute à la bande des ARNr... donc une dégradation de ceux-ci!

Nous faisons des dénaturations à la chaleur (avec snap-cooling) et gel d'urée (acrylamide dans notre cas) que lorsque nous avons besoin d'obtenir une bande nette dans le cas de transcrits in vitro (ou gels d'épissage, mais c'est une technique peu courante maintenant). Ceci dans le but de détruire les multiples structures secondaires.

Nous sommes un labo qui travaille de façon quotidienne avec de l'ARN (transcrits in vitro, extraction d'ARN, etc) et nous n'utilisons jamais de DEPC, juste des solutions autoclavées. Même les bacs à gels traînent à l'air libre, sans nettoyage. Il n'arrive qu'extrêmement rarement des dégradations, et d'habitude c'est dû à une contamination accidentelle de notre faute! Bref, n'ayons pas trop peur des vilaines RNases, en faisant un peu attention, c'est suffisant!

Bon désolé, je ne réponds pas tellement aux questions...

[emma59]

Merci pour tes explications. effectivement j'ai écrit ARNt au lieu de ARNr. Milles excuses.
Cela m'a rassuré de savoir que vous n'utilisiez que des produits autoclavés car mon labo travaille très peu sur l'ARN exceptée moi. J'avais un doute car j'ai testé la qualité de mes ARN stockés dans du RNA later qiagen comparé à du RNA later "maison" mais sans eau DEPC seulement autoclavée et j'ai eu une différence de qualité.J'ai aussi lu des arcticles où ils comparent la dégradation de l'ARN en comparant les taux de RNases restants après autoclave. Mais bon, en pratique apparemment l'autoclave suffit.
J'ai eu l'autorisation de passer des échantillons sur agilent (appartenant à un autre labo) je pourrais comparer.
Merci encore
Amicalement