Bonjour,
Pour extraire les ARN totaux d'une culture cellulaire ou bien de tissu j'utilise la méthode classique phénol-guanidine isothiocyanate-chloroforme. J'obtiens des ARN de bonne qualité or lors du dosage spectrophotométrique j'ai une absorption assez importante à 230nm qui est légèrement inférieur voire identique à l'absorbance à 260nm.
Il est connu que le phénol absorbe à 230nm mais y a t il d'autres composants qui pourraient absorber et comment m'en débarrasser ?
Merci
Bonjour,
Personellement, j'utilise les kit QIAGEN pour effectuer mes extractions. Cette méthode consiste à capturer les ARN totaux sur une colonne et de la nettoyer par la suite. La dernière étape consiste à récupérer les ARN dans de l'eau RNase free. Tu peux effectuer ton dosage par la suite sans soucis.
Ca ne reste qu'une alternative car (mon message perd ptet d'un coup tout son interêt) je ne sais pas résoudre ton problème
Il me semble probable que ce sont les traces de phénol qui te donne cette absorption.
Yoyo
Yep, je pense d'ailleurs que l'extraction se fait normalement en milieu alcoolique (qui va précipiter tes ARN) et que les reactifs du kit Qiagen ont pour objectif de nettoyer cet alcool à travers plusieurs étapes.
Si tu utilises une autre méthode, tu as certainement une partie du protocole qui t'explique comment enlever le phénol.
Quel kit utilises tu ?
Je n'utilise pas de kit, je suis le protocole d'extraction classique de chomzinsky et sacchi:
phénol/choloroforme
récupération phase acqueuse supérieure
précipitation des ARN par isopropanol
lavage du culot d'ARN par ethanol 70%
évaporation de l'éthanol en évitant de trop sécher le culot
resuspension dans de l'eau.
J'ai déjà testé l'ajout d'une étape lavage du culot à éthanol 70%, mais j'ai toujours cette absorption à 230nm !!!!!!
apres ton etape de phénol/chloroforme, fait une deuxieme etape qu'avec du chloroforme, ca te permettra d'éliminer les trace de phénol qu'il te reste.
Yoyo
Bonjour, excusez-moi de m'insérer dans votre discussion mais j'avais une autre question en fait. J'aimerai savoir à quoi servent toutes les manipulations lorsqu'on fait une extraction d'ARN et quelles sont les activités des différents produits utilisés comme le Trizol, le chloroforme, l'isopropyle...
Merci d'avance pour vos réponses qui me seraient d'une grande aide pour comprendre mon TP.
Marjorie
Je te conseille de lire la notice du trizol, il y a une partie explicative.
http://tools.invitrogen.com/content/...t%20061207.pdf
