Western blot et interférences?

[invite250af82d]

Bonjour à tous!

Je fais un stage dans un laboratoire d'immuno-pathologie et j'ai essayé de réaliser un western blot avec un extrait de Pyruvate déhydrogénase native (achetée chez une entreprise). Le but est de tester des sérums pour voir s'ils sont positifs pour l'une des trois sous-unités de la PDH.

J'ai un problème : mon échantillon protéique contient 10mg d'albumine bovine par ml... Cette albumine laisse une grosse tache sur mes blots (à 68 kD) et une des sous unités de la PDH est à 74 kD, et donc je ne sais pas si mes sérums sont positifs pour la PDH ou pour l'albumine...

Nous avons essayé de purifier la PDH avec du bleu sepharose, et effectivement j'ai moins d'albumine sur mes blots, mais je perds également une des sous-unités de la PDH en cours de route!!

Les sérums peuvent-il contenir des anticorps anti-BSA? Est-ce vraiment possible? Ou la bande que j'observe aux alentours des 70kD est quand même bien la sous-unité de la PDH?

Merci d'avance!!
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[gorben]

Salut,

Tu peux essayer d'epuiser tes Ac contre de la BSA avant ta manip, histoire d'eliminer le non specifique.
Le probleme c'est que souvent quand tu as une grosse "patate" de proteine, les Ac viennent se coller meme sans etre specifique. Tu peux aussi essayer d'augmenter le temps de ton etape de saturation (2h 5% lait dans PBST), ainsi que hybrider tes Ac avec 0.05% de lait dans PBST.

A+

[invitef9169c33]

Ou essaie peut-être d'avoir un gel plus résolutif ou de varier ton temps de migration afin de mieux séparer la sous unité de la PDH de ton albumine

[inviteca614eab]

Salut,

Peut etre que, tout en augmentant la résolution, tu pourrais tester en parrallèle un anticorps anti bsa pour etre sur que la bande que tu observes comigre bien avec ce que tu penses etre de la bsa. Je vais peut etre dire des bétises mais si tu utilises des sérums bovins (à moins que ce soit autre chose) tu auras donc des anticorps bovins anti bsa mais si ton anticorps primaire anti PDH n'est pas d'origine bovine (en général, c'est souris, lapin ou chévre), tu réveleras avec un anticorps secondaire (souris, lapin ou chévre) qui ne reconnaitra pas les anticorps anti bsa d'origine bovine. A moins que tu révele ta protéine différemment?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite250af82d]

Merci pour vos réponses!

J'ai utilisé un gel de polyacrylamide à 7.5%, et pour épuiser les éventuels anticorps anti-BSA de mes sérums, j'ai ajouté de la BSA dans mon tampon d'incubation des immunoblots... Effectivement, la tache que j'observe à la fin est beaucoup moins grosse et mes négatifs sont parfaitement négatifs.

Pour répondre à la question, je révèle mes immunoblots avec des sérums de patients pour voir s'ils ont des anticorps anti PDH! D'où la question que je m'étais posée, est-ce qu'un humain peut synthétiser des anticorps anti-BSA?

[invitef9169c33]

Je ne saurais pas répondre à ta question sur l'anti BSA (même si j'imagine que la réponse est non..) mais pourquoi tu ne fais pas un ELISA pour savoir si tu as des anti-PDH dans tes serums? Ta réponse serait quantitative et non semi-quantitative comme dans les WB..

Ceci dit, il est peut etre trop tard pour changer de méthode (les commandes ayant été lancées.. ) mais je me posais la question quand à savoir pourquoi ne pas avoir retenu cette méthode là..

[invite250af82d]

Nous n'avons pas fait d'ELISA parce que nous avions un cas particulier au labo avec un patient positif en immunofluorescence et négatif en immunodot (contenant la sous unité E2 de la PDH). Nous voulions par conséquent savoir si ce patient en question était positif pour une des autres sous-unités de la PDH, d'où la necessité du Western blot de la PDH complète afin d'identifier l'origine de cette positivité en IF!