[virologie et génétique] Virus de l'hépatite C

[invite6e2a6463]

Bonjour à tous, je suis en stage de M1 et je suis confronté à un problème dont je ne vois pas le bout !!

En fait je travaille sur l'ARN brin + du virus de l'hépatite C de génotype 1a. Mon but est de récupérer la séquence 5'UTR contenant l'IRES et la séquence 3'UTR ( 3 parties : région variable de 40pb, puis séquence poly U de 30 à 150pb, puis région conservée de 98pb que l'on nomme séquence X) puis de transférer ces deux parties dans un plasmide.

Mon problème c'est l'amplification de cette région 3'UTR, j'ai pensé à plusieurs choses comme :

- utiliser la queue poly A pour effectuer une RACE PCR mais je crains que ma Superscript 3 ne rajoute pas de queue poly A lors de la RT-PCR (mais il faut que je retourne voir la notice).

- Les amorces utilisées jusqu'ici ne m'ont donné aucun résultat après purification sur gel pour cette partie 3'UTR. Et je vous dis pas la galère pour trouver une amorce d'une région variable alors que je dois essayer de trouver une amorce valable pour tout les génotypes 1a ... (enfin qui permet d'amplifier cette région dans de nombreux cas).

- J'ai aussi pensé à prendre une amorce se liant à la séquence en amont de ma région 3'UTR (région NS5B)

Si quelqu'un à déjà fais ce type de manipulation et qui aurait d'autre idée, ou qui pourrait me dire où est mon erreur pour amplifier cette (gentille petite ggggggggggggrrrrrrr) région...

Merci pour votre aide.
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[invite71f23525]

As-tu essayé de faire une RT-PCR avec une amorce s'hybridant sur la queue polyA et une amorce sens suffisamment loin du 3'UTR (disons 1000-1500 pb en amont)? Après tu te rapproches de la région voulue par PCR emboitées ou nested-PCR, qui te permet d'augmenter la spécificité d'amplification du produit voulue. Pour la dernière nested-PCR, tu peux faire une plus grande avancée vers 3' avec une amorce sens, ainsi tu passe ton produit de PCR en gel d'agarose et tu découpes la bande la plus petite, correspondant à ton produit d'intérêt, et tu n'es pas embêté avec des bandes de tailles proches qui pourraient le contaminer. Le problème avec cette proposition, c'est lorsque tu vas arrivé à la région variable...Une solution est d'utiliser une amorce sens dégénérée quand tu arrives à cet endroit. L'avantage avec la nested-PCR est que tu devrais déjà avoir beaucoup de produit, donc même si le rendement de PCR est mauvais avec une amorce dégénérée, tu devrais sortir une quantité suffisante de produit.

La biologie moléculaire étant faites d'astuces autant que de protocoles tout établis, d'autres pourront te donner une bien meilleure réponse que moi s'ils sont passés par là.

Greg

[invite6e2a6463]

Merci pour ta réponse, malheureusement cette séquence ne contient pas de queue poly A. Donc l'amorce qui se fixe dessus !!!

Mais par contre je n'avais pas pensé à l'amorce dégénérée, il faut que je revois cette méthode car je ne m'en rappel plus.

merci pour ton aide.

[invite160a5434]

Bonjour,


Je vais peut etre dire une betise grosse comme la terre, mais pourquoi ne pas utiliser le DNA Shuffling pour amplifier ta séquence ?

[A voir en vidéo sur Futura]