Purification protéine taggée avec HIS6

[invitec9f0f895]

Bonsoir,

Je prevois de tenter la purification d'une protéine taggée en His6 a partir d'un extrait de levure sur une colone de nickel.

Avez-vous des conseils au niveau du protocol de purification? Y a t'il des "pieges" a eviter, ou des petits details qui font que les rendements de purif sont nettement meilleurs ?

Merci à ceux qui pourront me conseiller.

Yoyo
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[inviteb73ce398]

Avez-vous des conseils au niveau du protocol de purification? Y a t'il des "pieges" a eviter, ou des petits details qui font que les rendements de purif sont nettement meilleurs ?

Je dirai que le problème majeur est bien avant la purif et se trouve dans la production et la solubilité de ta protéine dans ton tampon d'extraction. Es-tu contraints de faire ca dans la levure? Quel niveau de "pureté" dois-tu obtenir?

[invitec9f0f895]

Salut,

Oui je sui sobligé d'utilisé la levure car il y a un evenement non conventionel de traduction qui se produit sur cet ARNm, or ce que je cherche a faire apres la purif est de passer la proteine en spectro de masse afin de determiner la séquence en aa d'une certaine région de la protéine.

Pour la pureté, comme l'echantillon est de toute maniere passe sur un gel de polyacrylamide j'imagine que meme si apres ma colone j'ai quelques contaminants ca ne doit pas etre un drame non?
Mon autre probleme est que je ne peux pas surexprimer cette protéine, je vais donc devoir me contenter de son taux d'expression endogène (que je ne connais pas)..quitte a faire 2L de culture.

Merci pour tous les conseils qui vous viendrait a l'esprit.
Yoyo

[inviteb73ce398]

Je vais avoir plus de questions que de réponses puisque les quelques productions de proteines His-tag que j'ai faites ne m'ont posé aucun problème particulier, ce qui est une chance, mais en général, pas très formateur

Oui je sui sobligé d'utilisé la levure car il y a un evenement non conventionel de traduction qui se produit sur cet ARNm, or ce que je cherche a faire apres la purif est de passer la proteine en spectro de masse afin de determiner la séquence en aa d'une certaine région de la protéine.

OK. N'y a t-il pas de meilleur moyen que la spectro de masse pour déterminer une séquence de protéine et d'une région particulière de surcrois??

Pour la pureté, comme l'echantillon est de toute maniere passe sur un gel de polyacrylamide j'imagine que meme si apres ma colone j'ai quelques contaminants ca ne doit pas etre un drame non?

En effet, a moins que le rapport contaminant/protéine d'intérêt soit largement en faveur des contaminants (ou un contaminant "mal placé"... mais ca ne serait quand même pas de bol...

Mon autre probleme est que je ne peux pas surexprimer cette protéine, je vais donc devoir me contenter de son taux d'expression endogène (que je ne connais pas)..quitte a faire 2L de culture.

Endogène taggé Histidine??? C'est un de ces trucs que tu peux faire avec la levure ou j'ai raté une étape!!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Tu as de la chance decidement

OK. N'y a t-il pas de meilleur moyen que la spectro de masse pour déterminer une séquence de protéine et d'une région particulière de surcrois??

J'ai la chance que les deux formes de protéines eventuellement attendue vont données des cartes de digestion a la trypsine différentes. Cela devrait donc etre "simple" à déterminer je pense.

Endogène taggé Histidine??? C'est un de ces trucs que tu peux faire avec la levure ou j'ai raté une étape!!

J'insere mon tag HIs6 par recombinaison homologue au locus du gène. Pour cela il suffit de transformer dans la levure ton produit de PCR effectué avec des amorces ayant 50nt d'homologie (à leur extrémité 5') avec la zone
ou tu cibles l'integration.

Yoyo

[invite9e6bc039]

J'insere mon tag HIs6 par recombinaison homologue au locus du gène. Pour cela il suffit de transformer dans la levure ton produit de PCR effectué avec des amorces ayant 50nt d'homologie (à leur extrémité 5') avec la zone
ou tu cibles l'integration.

Yoyo

Tu peux aussi faire un "pop-in"

Sinon pour la spectro de masse, tu n'as pas besoin d'une quantité énorme, la seule limite est de pouvoir repérer ta prot' sur gel. Ce que font les gens chez moi, c'est des gels 2D avant la mass spec' la purification est bien meilleur.

Perso, je ne miserais pas uniquement sur UNE stratégie... par exemple tu pourrais en profiter pour la taguer avec HA et faire de même.

[invitec9f0f895]

Oui en fait je pensais aussi a la technique du TAP tag pour la purifier, mais la tu as deux etapes sur colone donc forcément des rendements plus faibles.
Avec un tag HA, tu purifies comment? par immunoprecipitation?

Yoyo

[invite9e6bc039]

Oui, les Ab anti-HA mono-clonaux sont très efficaces (Babco, ascite fluid)

[inviteb73ce398]

Oui en fait je pensais aussi a la technique du TAP tag pour la purifier, mais la tu as deux etapes sur colone donc forcément des rendements plus faibles.
Avec un tag HA, tu purifies comment? par immunoprecipitation?

Dans ton cas, je ne vois pas ce que le tap-tag t'apporterai. Je crois que le choix du His-tag est plutot bon (a quand la recombinaison homologue en routine chez les eucaryotes superieurs??!!).
Les IP marchent bien mais tu as besoin de cross-linker ton anticorps sous peine de masquer ou fortement contaminer ton signal. Et pour la quantite de materiel, ca depend de la technique de mass spec que tu utilises: MALDI plus sensible mais gere mal les melanges d'ou le passage en gel 2D conseiller, ou electrospray (ESI) ou la la quantite de materiel requise pour l'analyse est plus importante mais les melanges sont analysables et du coup la 2D n'est pas necessaire.

[invitec9f0f895]

Merci a tous pour vos réponses.
Je vais tenter en His6 et voir ce que j'obtiens sur gel... si c'est suffisant je passerai ca en mass spec.

Le tap tag initialement car j'avais deja les vecteurs je pensais ne faire qu'une etape de purife. mais ca rajouter pas mal de sequence, d'ou un clivage necessaire et donc une deuxieme purife... bref...


Yoyo