Extraction protéique au laemmli ?

[invite85934679]

Bonjour,

J'ai une petite question sur une manip que je fais en ce moment. J'étudie une protéine sur laquelle j'ai fait quelques délétions pour caractériser un peu mieux ces fonctions. J'ai transfecté les plasmides dans des HeLa, extraction des protéines au RIPA, migration et WB... J'ai un signal pour toutes les mutations sauf une.
La première fois, j'ai pensé que j'avais oublié l'ADN, mais je l'ai refait une deuxième fois et même résultats.
Afin de voir si elle était exprimé, j'ai regardé en immunofluorescence, et j'ai un signal pour cette protéine. Donc elle est bien exprimé dans mes cellules. Par contre, la localisation de la protéine change et se retrouve dans des structures nucléaires (genre aggrégats).

Je me suis demandé si l'extraction au Ripa était la cause, et qu'il faudrait peut-être une extraction plus brute. Donc j'ai refait la manip et repris directement le culot de cellules dans du laemmli. Chauffé 5min à 90°C et centrifugé 1min.
Après migration et transfert sur membrane, la coloration en ponceau est ignoble et le western est très moche.

Vu que je n'ai jamais fait d'extraction directement au laemmli, voici ma question :

- Faut t'il rajouter des étapes (centri, sonication, seringue...) ? pour améliorer l'échantillon ?

Merci beaucoup si vous avez des idées !!

FX
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[invite04b7040c]

normalement il faut soniquer apres extraction au laemmli, sinon l'ADN rend l'echantillon visqueux et du coup il se sépare mal lors de l'électrophorèse
dsl je pense que c'est un peut trop tard comme réponse mais bon, sa peut toujour servir

[invite7e055e83]

J'ai des petites questions (peut-être un peu bêtes mais l'échantillon repris dans du Laemmli froid est très visqueux)

Lorsque tu reprends ton culot de cellules dans le Laemmli, est-ce que tu le reprends dans du Laemmli bouillant au préalable puis tu soniques puis tu re-chauffes l'échantillon soniqué?
Ou bien est-ce que tu reprends ton culot dans du Laemmli froid puis tu soniques puis tu chauffes l'échantillon soniqué?

Merci d'avance