Extraction protéique pour western blot

[invite9a7a6874]

Bonjour,

voilà je dois faire du western blot jeudi et je n'en ai jamais fait... on va m'encadrer pour toute la manip sauf pour l'exctraction protéique.

la protéine que je souhaite detecter est cytoplasmique.

auriez-vous un protocole maison pour lyser mes cellules?
on m'a dit de faire eun tampon contenant du tris, du Nacl 50mM, Mgcl2, EDTA, NP40 mais je n'ai pas mes concentrations ni les quantités.
En plus je ne suis pas sûre d'avoir du NP40... y a-t-il un autre detergent que je peux utiliser?

suis-je obligée de faire un dosage après?? si oui quel est le protocole?

Merci de vos réponses

nanie
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[invitea0443c8c]

Bonjour!
Que voulez vous faire avec les lysats ensuite? Purif? IP? ou simple lysat total? Si c'est cette denière solution que vous choisissez vous n'avez qu'à lyser vos cellules avec du Laemli bouillant (avec DTT ou beta-mercapto).

V.

[invite9a7a6874]

bonjour,

je souhaite effectuer un western blo ensuite

je tiens a preciser que je n'ai pas de Laemmli ou quoique ce soit de " prêt" je dois faire mon propre tampon.

[invitea0443c8c]

Oui j'ai bien comprit que vous vouliez faire un western mais allez vous purifier vos lysat ou pas? Est ce que vous voulez charger directement votre lysat cellulaire sur votre gel sans immunoprécipiter ou purifier avant?
Le laemli buffer est un tampon très simple à faire et universellement utilisé.


V.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite85934679]

Salut, voilà un petit protocole rapide pour l'extraction des protéines. Attention, vu que tu n'as pas précisé quel est le type de cellules que tu utilises, je te donne celui que j'utilise : extraction de protéines à partir de cellules de mammifères Hela (marche avec pleins d'autres types cellulaires bien évidemment). Je cultive les cellules sur boite (comme ce sont des cellules adhérentes), le protocole est donné pour extraire les protéines de cellules sur une boite de 6cm de diamètre.
Pour le dosage, tu peux utiliser le BCA de Pierce, ou le Bradford classique. Le BCA est mieux car presque pas d'absorbance pour le RIPA.

- Préparation du tampon d’extraction « RIPA-N base» pour 50ml :
o 0,5ml Nonidet P-40
o 2,5ml Tris pH8 1M
o 1,5ml NaCl 5M
o 0,5ml SDS 10%
o 2,5ml Deoxycholate de sodium 10% (0,5g dans 5ml d'eau)
o 100ul EDTA
o 34,750ml H2O

- Ajouter extemporanément pour 1ml final :
o 844ul de tampon d’extraction « RIPA-N base »
o 2ul AEBSF 0,5M
o 5ul KF 1M
o 5ul Beta-glycerophosphate 1M
o 1ul DTT 1M
o 143ul inhibiteur protéases 7X (soit une tablette dans 1,5ml H20)

- Rincer la boite 3 fois avec 4ml de PBS
- Ajouter 200ul de « RIPA-N base + additifs » sur la boite
- Mélanger pendant 5min en remuant à la main la boîte
- Transférer le grumeau dans un tube eppendorf 1,5ml et vortexer 3 fois 30s
- Centrifuger 10 min à 4°C à fond
- Récupérer le surnageant et doser

- Dosage des protéines
o Utiliser le KIT BCA de Pierce
o Préparer le mélange des réactifs (1 volume de B pour 50 volumes de A) – 1ml nécessaire pour chaque échantillon à tester + 1 pour le blanc + 9 pour la gamme BSA
o Préparer la gamme BSA (à partir d’une ampoule BSA 2mg/ml:
• Tube A : 30ul Stock BSA (→ 2mg/ml)
• Tube B : 37,5ul Stock + 12,5ul H20 (→ 1,5mg/ml)
• Tube C : 32,5ul Stock + 32,5ul H20 (→ 1mg/ml)
• Tube D : 17,5ul Tube B + 17,5ul H20 (→ 0,75mg/ml)
• Tube E : 32,5ul Tube C + 32,5ul H20 (→ 0,5mg/ml)
• Tube F : 32,5ul Tube E + 32,5ul H20 (→ 0,25mg/ml)
• Tube G : 32,5ul Tube F + 32,5ul H20 (→ 0,125mg/ml)
• Tube H : 10ul Tube G + 40ul du H20 (→ 0,025mg/ml)
• Tube I : 40ul d’H20 (→ 0mg/ml)
o Dans un tube eppendorff 1,5ml, ajouter 1ml de réactif (A+B) et 5ul d’extrait protéique ou de gamme BSA. Ne pas oublier de faire un blanc pour les protéines (5ul de « RIPA-N base + additifs »)
o Vortexer brièvement
o Incuber 30min à 37°C
o Doser les tubes au dosimètre à 562nm
o Conserver les tubes dans la glace

- Préparation des échantillons pour western-blot :
o Décongeler les tubes dans la glace
o Pour la migration, utiliser 15-20ug de protéines par piste soit dans un tube eppendorff 1,5ml :
• 1 volume de protéines
• 1 volume de tampon de dépôt Laemmli 2X (pour 10ml) :
• 1ml Tris HCl pH 8 1M
• 2ml DTT 1M
• 4ml SDS 10%
• 200ul Bleu de Bromophénol 0,5%
• 2ml glycérol 100%
• 800ul H20
• si nécessaire, si le volume est trop faible (inférieur à 10ul), rajouter du laemmli 1X
o Chauffer le tube pendant 5 min à 95°C
o Centrifuger 1min
o Incuber dans la glace jusqu’au dépot

Si tu as des questions, n'hésite pas.

FX

[invitea0443c8c]

Tout ceci est parfaitement inutile si on veut analyser un lysat cellulaire total.
La lyse en laemli buffer exclue le dosage (sauf si le laemli ne contient pas de bleu) mais le dosage est facultatif. Si l'ensemencement est bien fait et si la manipe de complexifie pas les conditions de culture (culture en suspension par exemple) on doit trouver une actine équivalente sans faire de dosage. D'où ma première question.

V.

[invite85934679]

Je suis bien d'accord Vinc, mais je trouve ça léger de balancer à quelqu'un qui fait pour la première fois une extraction de protéines : bout le dans du laemmli...

Même si mon protocole est peut être trop long, il est néanmoins complet, et peut être fait en une 1/2 journée. Au moins, il pourra comprendre toutes les étapes, savoir ce qu'il y a dans le tampon, savoir combien il mets de protéines pour son gel... Bien sûr que c'est pas primordial pour juste vérifier si ta prot est bien là dans ton extrait, mais bon, j'imagine que si sa manip marche, il va devoir en faire d'autres, avec peut-être plusieurs boites, donc il faudra mettre une quantité équivalente pour chaque puits... Alors pourquoi ne pas lui indiquer tout de suite la marche à suivre, et le laisser être "créatif" quand il maitrisera la technique? Bien évidemment, maintenant, je fais ça sans doser car je sais à quelle concentration je m'attends, mais c'est après avoir automatisé la technique.

FX

[invite17a570c1]

Je suis bien d'accord Vinc, mais je trouve ça léger de balancer à quelqu'un qui fait pour la première fois une extraction de protéines : bout le dans du laemmli...

Oui et non : à partir du moment où la personne sera encadrée pour le Western, je ne vois pas pourquoi il faut lui faire suivre un protocole complet autre que celui de son encadrant.

avec peut-être plusieurs boites, donc il faudra mettre une quantité équivalente pour chaque puits...

C'est une chose qui ne se décide pas au niveau de la purification, à mon humble avis... Or, la question ici porte sur l'extraction

Alors pourquoi ne pas lui indiquer tout de suite la marche à suivre, et le laisser être "créatif" quand il maitrisera la technique?

Avant d'être créatif dans sa technique, faudrait déjà savoir comment on fait un tampon... Pour être pédagogique, il ne suffit pas de donner un tout très détaillé, il vaut mieux y aller doucement en satisfaisant déjà des demandes de base Quand quelqu'un ne sait pas comment préparer un tampon de base en ayant tant de Tris xM et tant de MgCl₂ yM, vaut peut-être mieux lui expliquer tout d'abord comment on calcule les volumes. C'est niveau L1-L2 chimie, mais ça pose problèmes à beaucoup de monde.

Ceci dit, Fox, ce n'est pas une critique envers ce que tu as fait C'est tout à fait louable d'avoir pris le temps d'écrire tout ça et d'être dispo pour d'éventuelles questions. C'est juste une critique envers la nécessité de l'avoir fait au vu des circonstances


Cordialement,

[invite9a7a6874]

merci a tous pour vos réponses!

alors Vinc pour répondre à votre question : je ne pense pas purifier juste faire un lysat total.
mes cellules sont des cellules HepaRG (cellules adhérentes pour simplifier ce sont des cellules bipotentes hépatiques et biliaires).

FX : merci pour ce protocole, il répond amplement à ma question.

le problème est que je ne pense pas avoir assez de temps pour faire le dosage. est-ce grave?

je ne dispose pas non plus de tous les composants nécessaires aux tampons (NP 40 mais j'ai du triton X-100 ; Deoxycholate de sodium ; AEBSF ; KF ; Beta-glycerophosphate ; DTT)

pensez-vous qu'un tampon comme celui-ci pourrait marcher?

- Tris HCl 1.5M
- NaCL 5M
- Triton X-100 (1%)
- Anti-protéases (je ne suis même pas certaine d'en avoir dans le service)

MaliciaR : je sais comment calculer des volumes (heureusmeent quand même arrivée en Master 2.. ) ma question portait plus sur les composants et les concentrations du tampon de lyse, ainsi que les étapes à effectuer.
J'ai déjà effectuer des exctrations protéiques mais c'était avec un kit nettement plus simple ^^

merci encore a tous pour vos réponses

nanie

[invite9a7a6874]

je tenais juste à préciser :

que je ne dispose que de 2h avant de pouvoir lancer le wetern d'où le manque de temps pour le dosage

et que mes expériences sont faites dans des plaques 24 puits, ca va peut-être jouer pour récuperer mes lysats non?

[invitea0443c8c]

Je suis bien d'accord Vinc, mais je trouve ça léger de balancer à quelqu'un qui fait pour la première fois une extraction de protéines : bout le dans du laemmli...

Pourquoi donc? C'est au contraire l'approche la plus simple (et la plus robuste) pour quelqu'un qui débute.
Toi à l'inverse tu "payes une Porshe à un jeune qui vient d'avoir son permis".
Ton protocole est long, complexe et inutile pour une simple extraction totale : ça multiplie juste les chances de se planter.

Même si mon protocole est peut être trop long, il est néanmoins complet, et peut être fait en une 1/2 journée. Au moins, il pourra comprendre toutes les étapes, savoir ce qu'il y a dans le tampon, savoir combien il mets de protéines pour son gel... Bien sûr que c'est pas primordial pour juste vérifier si ta prot est bien là dans ton extrait, mais bon, j'imagine que si sa manip marche, il va devoir en faire d'autres, avec peut-être plusieurs boites, donc il faudra mettre une quantité équivalente pour chaque puits...

Ce protocole est un protocole d'IP. On utilise pas un RIPA pour faire un extrait cellulaire total parce que c'est absurde (sauf à la limite si l'on veut doser). Un RIPA permet de faire des IP (principallement). Tu utilises certainement ce protocolle en routine mais ne t'imagine pas qu'il peut être décliné à toutes les sauces, y comprit pour les manipes simples.

Alors pourquoi ne pas lui indiquer tout de suite la marche à suivre, et le laisser être "créatif" quand il maitrisera la technique? Bien évidemment, maintenant, je fais ça sans doser car je sais à quelle concentration je m'attends, mais c'est après avoir automatisé la technique.

Mais ca n'a absolument rien à voir avec l'automatisation. Si l'ensemencement des cellules est bien fait il n'y aura aucune différence en western point final. C'est la multiplication des étapes qui introduit des erreurs. Lorsque tu fais une manipe dans laquelle les cellules ne prolifèrent pas à la même vitesse, ou lorsque la quantité de protéine est rédibitoire car pouvant entrainer des saturation etc... là ok il faut doser. Mais doser le sprotéine systématiquement c'est long et inutile. J'ajouterai même que lorsque je fais des dosages je les fais en triplicat et j'ai très régulièrement un point qui ne va pas, détail qui souligne que le dosage lui même peut également induire en erreur (c'est du vécu).

alors Vinc pour répondre à votre question : je ne pense pas purifier juste faire un lysat total.
mes cellules sont des cellules HepaRG (cellules adhérentes pour simplifier ce sont des cellules bipotentes hépatiques et biliaires).

Si tu veux une manipe simple pour obtenir un résultat rapidement je te conseille alors (histoire d'insister très lourdement) de lyser avec du laemli bouillant (MP pour le protocole, très simple).
[démago=ON]Si tu veux te planter pour ton premier western fais un RIPA et un dosage.[/démago]

V.

[invite85934679]

Resalut,

Alors, je pense effectivement que tu peux faire avec ce que tu as. En fait, le RIPA peut être fait avec du NP40 ou du triton, donc du Triton à 1% fera l'affaire.

Tout ce que tu n'as pas, c'est globalement des antiprotéases. En fait, plus tu en mets, moins tu as de chances que tes protéines soient dégradées. Donc à mon avis, tu tentes avec du :

- Tris HCl 1.5M
- NaCL 5M
- Triton X-100 (1% final)
- SDS 0,1% final (si tu en as)
- Anti-protéases (si tu en as)

Théoriquement, ça devrait marcher. Pour les plaques 24 wells, moi je testerai avec 20-30ul...

Pour le dosage, dès que tu as les protéines, tu peux le faire immédiatement. Un dosage BCA, ça prend 45min tout compris. Un dosage Bradford, un peu moins. Maintenant, si tu n'as que 2h pour extraire les protéines et faire le dosage... C'est un peu short mais c'est faisable, en préparant tout à l'avance.

Bon courage!!

[invite9a7a6874]

merci beaucoup!!!

je vais faire avec ca merci encore à tous

[invite85934679]

D'accord avec toi Vinc pour le laemmli.
Je disais juste ça parce que je me doute que la première fois que tu as fais une extraction prot à partir d'une boite, si tu n'avais pas dosé, tu allais mettre au pif une quantité de protéines. Avec un risque de charger trop (ou pas assez) ton puits.
S'il veut être dans une quantité de protéines raisonnable pour le dépot, il faut qu'il dose au moins une fois pour connaître la quantité moyenne qu'il récupère. Dans le tampon laemmli, comme tu l'as dit, on ne peut pas doser à cause du bleu (et encore, même sans bleu... y a tellement de SDS dedans que ton réactif va surement absorber au delà de la limite lors du dosage). Donc pour éviter de refaire la manip une deuxième fois, je pense que c'est mieux de doser cette fois ci pour être tranquille plus tard.

FX

[invitea0443c8c]

Alors, je pense effectivement que tu peux faire avec ce que tu as. En fait, le RIPA peut être fait avec du NP40 ou du triton, donc du Triton à 1% fera l'affaire.

Alors pourquoi avoir donné une liste à rallonge?

Tout ce que tu n'as pas, c'est globalement des antiprotéases. En fait, plus tu en mets, moins tu as de chances que tes protéines soient dégradées.

Et encore moins de chance de dégradation lorsque tu mets ton laemlli directement sur tes cellules...

Pour le dosage, dès que tu as les protéines, tu peux le faire immédiatement. Un dosage BCA, ça prend 45min tout compris. Un dosage Bradford, un peu moins. Maintenant, si tu n'as que 2h pour extraire les protéines et faire le dosage... C'est un peu short mais c'est faisable, en préparant tout à l'avance.

Un ensemencement précis prend une minute
Et en faisant ton dosage à la va vite avec le stress du chrono tu as d'autant plus de "chances" de te planter.

D'accord avec toi Vinc pour le laemmli.
Je disais juste ça parce que je me doute que la première fois que tu as fais une extraction prot à partir d'une boite, si tu n'avais pas dosé, tu allais mettre au pif une quantité de protéines. Avec un risque de charger trop (ou pas assez) ton puits.
S'il veut être dans une quantité de protéines raisonnable pour le dépot, il faut qu'il dose au moins une fois pour connaître la quantité moyenne qu'il récupère. Dans le tampon laemmli, comme tu l'as dit, on ne peut pas doser à cause du bleu (et encore, même sans bleu... y a tellement de SDS dedans que ton réactif va surement absorber au delà de la limite lors du dosage). Donc pour éviter de refaire la manip une deuxième fois, je pense que c'est mieux de doser cette fois ci pour être tranquille plus tard.

Je peux comprendre ça mais le problème est que lorsque tu débutes le dosage peut devenir inutile (s'il ne l'était pas déjà comme c'est le cas ici) de part l'imprécision du pipetage (dû au fait que tu débutes justement)... Et je n'ai jamais dosé mes protéines pour un extrait cellulaire total, jamais eu de problème non plus.


V.

[piwi]

Salut,

Je rejoins totalement Vinc surtout en sachant que vous ne disposez que de 2h pour préparer le western.
Un peu de Laemmli (je ne sais jamais l'écrire ce nom) dans le puit tu récupères tes cellules et tu boues ou mieux tu soniques (l'échauffement va faire office de bouilloire). Normalement si tu as des cellules en culture le dosage est peu intéressant, tu peux evaluer la confluence à l'oeil.

Cordialement,
piwi

[Zellus]

Salut,

Je trouve vos concentrations en Tris-HCL et NaCl énormes !! Je n'y connais rien en manip sur des cellules eucaryotes donc c'est peut-être normal . Mais pour les bactéries j'utilise plutôt des concentrations du genre 10 à 50 mM pour le Tris-Hcl et 100 à 500 mM pour le NaCl, et ça suffit largement. Et ça vous ferait faire pas mal d'économies au passage ... Sinon OK pour Triton et SDS.

Pour ce qui est des inhibiteurs de protéases, ça me paraît quand même assez indispensable. Sinon ta protéine a plus de chance d'être dégradée et tu multiplies les risques d'avoir plusieurs bandes correspondant à ta prot sur le western blot. L'EDTA que tu as dans ton tampon est un inhibiteur donc tu devrais le rajouter (1 mM voire plus si tu n'as que ça).

Cordialement,
Zellus