Western blot + extraction proteine

[inviteec077029]

Bonjour,

J'ai besoin de vos avis!

Alors voila, je cultive des fibroblastes cutanés en flask de 75cm2 sur lequel j'aimerais faire une extraction de proteines totales pour ensuite faire un WB pour pouvoir detecter ma prot d'intêret.
J'ai achetée le tampon de lyse "RIPA" que je vais utiliser mais je sais pas vraiment comment faire pour l'extraction est-ce que préalablement je dois gratter ou trypsinés mes cellules? est-ce que je dois faire sa sur seulement un flask ou plusieurs ? quel volume de RiPa dois-je utiliser sur un flask de 75cm2 sur lequel je compte 3.10¨5 cellules/ml?
est ce que je dois ensuite concentrer pour avoir une quantité sufffissante sur WB?

Est-ce que quelqu'un à un protocole optimisé pour l'extraction de prot totales sur fibroblastes cutanés?

Voila merci pour vos éventuels réponses
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[fxmulder]

Salut,
Pour extraire les protéines de cellules musculaires (pour ma part des C2C12, myoblastes de souris) j'utilise également du RIPA.
Après, ce que je fais dépend de la quantité de cellules que j'ai sur la boite. Lorsque j'ai une boite de 10cm, à 80-90% de confluence, je met 500ul de RIPA sur la boite et je la penche pour bien mettre le liquide partout pendant 5min. Normalement, la très grande majorité des cellules éclatent à cause de tous les détergents. Je récupère le liquide, je le vortex 3 fois 30s pour bien tout détruire, et je centrifuge 10 min à 13000g dans des eppendorff à 4°C. Ton surnageant correspond à tes prots, le reste (culot blanc au fond représente les débris cellulaires).

Par contre, si je n'ai pas beaucoup de cellules sur ma boîte, ou si j'ai peur que les protéines soient trop diluées, je racle mes cellules dans du PBS et je transfère le tout dans un eppendorf. Je centrifuge un peu pour faire tomber les cellules, un lavage au PBS en plus, et je reprend le culot dans 50ul de RIPA. Et là, tu centrifuge comme un malade pendant 10min (pour être sûr).
Tu centrifuge et récupère le surnageant.

Le mieux est de tester la deuxième solution dans ton cas, avec peu de volume de RIPA, tu le dilueras plus tard si c'est trop concentré.

N'oublie pas tous les additifs au RIPA pour que ça marche bien.

Bon courage, et tiens nous au courant.

FX

[Vinc]

Bonjour!
Attention attention, le RIPA est un buffer principallement utilisé pour faire des IP. Si ce sont les protéines totales qui vous intéressent ce n'est pas une extraction en tant que telle qu'il faut faire, il vaut mieux lyser classiquement vos cellules dans du Laemli 1X avec béta-mercapto ou DTT. On se fiche des débris cellulaire, on récupère un lysat total que l'on va ensuite charger sur gel.
En ce qui concerne le volumen de lyse, je ne travaille pas en flasque, mais je lyse une boite de 6cm avec environ 1 à 2 millions de cellules, et ensuite je charge environ 15 à 25 µL ce qui correspond à 30000 ou 50000 cellules par puit. Mais après tout dépend de la protéine que vous voulez détecter.

V.

[fxmulder]

Je suis d'accord avec Vinc, mais si je me trompe il est impossible de doser ces protéines dans le laemlli... Alors si on veut faire un dépot avec une quantité précise, je préconiserai le RIPA-N, puis un dosage protéique, et enfin la reprise du volume nécessaire de protéines avec un volume équivalent de laemlli 2X.

Il me semble que c'est bon comme ça. Faire seulement attention au dosage, le RIPA-N interfère avec le dosage bradford... Il vaut mieux utiliser le dosage BCA de Pierce.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Vinc]

Oui le dosage dans le Laemli n'est pas possible en effet, mais il n'est pas forcément necessaire de doser les protéines. L'expérience du manipulateur ainsi qu'un contrôle adapté en western permettent d'obtenir un résultat impeccable (je ne fais que des western et j'ai arrêté de doser mes protéines assez rapidement). Et je rajouterai que les dosages sont eux même soumis à erreurs et variations.
FXmulder, tu utilises un protocole prévu pour faire des IP, mais ce n'est pas le cas de notre ami. Il existe plusieurs manières de faire en fonction de ce que l'on veut voire.

V.

[inviteec077029]

Le mieux est de tester la deuxième solution dans ton cas, avec peu de volume de RIPA, tu le dilueras plus tard si c'est trop concentré.

N'oublie pas tous les additifs au RIPA pour que ça marche bien.

Bon courage, et tiens nous au courant.

FX[/QUOTE]

Enfaîte, j'ai déjà fais exactement ce que tu dis ! J’ai essayé exactement comme sa mais la seule différence c'est que j'ai pas vortex comme un malade pendant 10 min.
le problème c'est qu'en WB je n'ai rien ! Alors je me suis demandé si 50µl c'est suffissant pour tout extraire, en tous cas j'ai dosé par BCA et j'obtiens environ 2mg/ml et je crois que c'est insuffisant pour voir une bande en WB.
Que me suggérer vous?

[inviteec077029]

Vous allez surement dire que si sa marche pas en WB c'est probablement du à plein d'autres choses... mais sa vient pas techniquement du WB parceque la proteine je la detecte dans le milieu (aprés avoir concentré 40fois) des cellules c'est à dire avant la lyse mais dans le culot j'ai rien ce qui est pas normal

[inviteec077029]

Non je ne fais pas d' IP pour l'instant, il s'agit de mettre en place au mieux la lyse et le WB de la prot; dans l'avenir je serais amené à faire du pull chase mais pas pour le moment.

Pour le moment je prépare 10 flasks.
Je vais suivre tous vos conseils!

-2 Flask je vais faire une lyse classique comme le préconise VINC (laemli+DTT)
-2 Flask 500ul RIPA (1er idée de fxmulder)
-2 Flask 50ul RIPA (2eme idée fxmulder)

Les autres flasks je les réserves pour d'autres idées!!

[fxmulder]

Resalut,

A mon avis, si tu ne vois pas ta prot dans ton culot, c'est que les cellules n'ont pas du être très bien lysées. Pourrais tu donner la composition de ton RIPA final que tu utilise pour lyser les cellules ?

Sinon, avec 2mg/ml, c'est suffisant, j'obtiens ça en général à partir d'une boite de 10cm dans 500ul de RIPA, et je migre 15ug sur un gel d'acryl. Dépendant si la prot est fortement ou faiblement exprimé, je détecte sans problème avec du luminol (ou au luminol femto si c'est trop faible).

FX

[inviteec077029]

oui mais moi j'ai 2mg/ml dans 50µl !
Tampon final: le tampon RIPA+ des antiproteases (tablet mini roche)