Bonjour à tous,
J'aimerais faire de l'immunofluorescence sur cellules en culture (Hs683).
J'ai l'habitude d'en faire mais avec l'anticorps qu'on vient de produire j'ai un peu de mal. Ce que je veux voire est une protéine endogène membranaire, et j'aimerais faire du confocal.
Mon problème est que je n'ai pas de marquage spécifique ni en fixation PFA ni en fixation méthanol. J'ai tenté de faire des perméabilisations TritonX100 0,1% ou 2% ; ou SDS 0,1% ou 0,5% ( sur chaque mode de fixation)....rien mis à part un bruit de fond faible sur l'ensemble des cellules.
Je viens de tomber dans la littérature sur un papier dans lequel ils observent la même protéine que moi. Ils le font sur des coupes de tissus en cryostat, fixées en éthanol 100% 4°C 30min puis acétone -20°C 3min puis ils font sécher la coupe et la réhydrate avec du PBS. Enfin ils perméabilise en TX100 0,2%.

Pensez-vous que ce protocol serait applicable à mes lamelles de cellules en culture ?
Sinon, à quoi sert l'acétone dans cette méthode de fixation?
Et enfin, est-on obligé de perméabiliser après fixation méthanol ?

Voilà ça fait beaucoup de questions je suis désolé...mais en plein mois d'août je suis seul au labo et donc n'ai personne à qui poser ces questions.

Merci d'avance à tous.