[Manips Labo] Produire et purifier du ssDNA

[mantOs]

Bonjour à tous.

Je fais un appel à témoins pour rassembler un max d'infos qui pourraient m'aider.

En ce moment j'essaye de produire un ssDNA par PCR asymétrique en utilisant mon fragment purifié comme matrice et qu'une seule amorce.

Les résultats sont assez encourageant car je vois bien ma bande ssDNA : mon fragment purifié fait 300 pb et la bande inférieure est bien du ssDNA (test nuclease S1 effectué). gel 2% agarose.




En gros je fais appel à vous pour savoir si vous avez des astuces pour :

1- améliorer mon rendement de PCR ssDNA ( j'ai fais varier les cycles les concentrations et ca change pas beaucoup ... )

2- une bonne technique de purification de ce ssDNA ( le seul essaie de kit s'est soldé par un echec) les Kit commerciaux affirment que le ssDNA se fixe sur les colonnes mais rien n'est connu quant à l'efficacité ...

Donc voila un peu mes questions, si vous avez des réponses quel qu'elles soient pour m'éviter de perdre du temps ca serai super merci


Bonne continuation.
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[IngDr]

Salut,

J'ai jamais fait de ssDNA, mais j'ai quelques remarques

remarque 1 :
si tu fais une PCR avec une matrice, et 1 seul primer, ta réaction n'est pas exponentielle, mais linéaire en fonction du nombre de cycle. Donc il faut des quantités de matrices beaucoup plus importantes.
Quand tu dis que tu as augmenté les quantités et les cycles, c'est une augmentation de quelle ordre ?

remarque 2 : une "simple" purif phénol chlo et précipitation ne marche pas ? Sinon pour le kit commercial, étais tu dans les quantités recommandées (i.e. si tu as trop peu de matériel, tu risques de perdre le matériel). As tu la possibilité de rajouter un ADN "neutre" pour tes manips ? ou du glycogène pour la précipitation à l'éthanol ? Tu veux purifier pour enlever quoi au fait ? Les primers, les enzymes, la matrice ?

remarque 3 : si ton fragments fait 300 "bp" (base pair), c'est du dsDNA pas du ssDNA

[mantOs]

Salut,

J'ai jamais fait de ssDNA, mais j'ai quelques remarques

remarque 1 :
si tu fais une PCR avec une matrice, et 1 seul primer, ta réaction n'est pas exponentielle, mais linéaire en fonction du nombre de cycle. Donc il faut des quantités de matrices beaucoup plus importantes.
Quand tu dis que tu as augmenté les quantités et les cycles, c'est une augmentation de quelle ordre ?

Alors pour la quantité de matrice j'ai fait que peu de conditions j'ai testé de doubler la quantité et j'ai pas amélioré (voir inhiber la formation de ssDNA) .
Il faudrait que je paramètre mieux sur ce plan là, les seules modifs que j'ai testé actuellement c'est la quantité d'amorces.

Le nombre de cycles j'ai testé 20 et 30 cycles .

remarque 2 : une "simple" purif phénol chlo et précipitation ne marche pas ? Sinon pour le kit commercial, étais tu dans les quantités recommandées (i.e. si tu as trop peu de matériel, tu risques de perdre le matériel). As tu la possibilité de rajouter un ADN "neutre" pour tes manips ? ou du glycogène pour la précipitation à l'éthanol ? Tu veux purifier pour enlever quoi au fait ? Les primers, les enzymes, la matrice ?

Pour la précipitation j'ai pas essayé. Est ce faisable pour purifier sur gel après migration ? Car il faut que j'ai que mon ssDNA .
Pour le kit , je suis limité par la quantité produite pendant ma PCR et sur gel il semble y en avoir assez pour utiliser ces kit.

Pour l'ADN neutre, je connais pas .

Ce que je veux purifier c'est uniquement mon ssDNA . Et donc enlever la matrice (surtout).

remarque 3 : si ton fragments fait 300 "bp" (base pair), c'est du dsDNA pas du ssDNA

Mon fragment purifié fait 300 "bp" et est bien ma matrice je n'ai mentionné à aucun moment ssDNA (qui fait donc 300 nt)

[gorben]

Salut,

Pour ma part j'avais fait une PCR 90 cycles (denaturation courte et enzyme tres resistante a la chaleur) sur une toute petite quantitee d'ADN plasmidique (methyle) que j'avais ensuite digere par DpnI. Aucun besoin de purif

J'avais aussi fait directement une purif "PCR cleanup", c'etait pas mal mais j'avais prefere la methode DpnI

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[mantOs]

Salut,

Pour ma part j'avais fait une PCR 90 cycles (denaturation courte et enzyme tres resistante a la chaleur) sur une toute petite quantitee d'ADN plasmidique (methyle) que j'avais ensuite digere par DpnI. Aucun besoin de purif

J'avais aussi fait directement une purif "PCR cleanup", c'etait pas mal mais j'avais prefere la methode DpnI

A+

Avec une paire d'amorces alors?? Sinon sur le plasmide ça élongue toute la longueur . Il me faut pour ma part elonguer que ma séquence de 300 nucléotides.

Et vu que je fais ma PCR avec le double brin purifié (non methylé ) = pas de DpnI possible

[gorben]

Salut,

Quand j'ai ecris ca il me semblait bien que qq chose clochait ! Merci de m'avoir repris. Mon template etait un insert purifie a partir d'un plasmide methyle. J'amplifiais bien un ssDNA

Desole pour l'erreur !

A+

[mantOs]

Salut,

Quand j'ai ecris ca il me semblait bien que qq chose clochait ! Merci de m'avoir repris. Mon template etait un insert purifie a partir d'un plasmide methyle. J'amplifiais bien un ssDNA

Desole pour l'erreur !

A+

Ca pourrait marcher mais faudrait que je purifie à partir d'une grosse quantité de plasmide !

Merci quand même, toujours bon de réfléchir comme ça.

[gorben]

Salut,

J'ai plus mon cahier de manip, mais je ne pense pas avoir depasse les 100-200 ng de template. Le rendement est pas si mauvais en PCR une seule amorce (d'ailleurs est ce qu'on peut encore parler de PCR?)

A+

[mantOs]

Salut,

J'ai plus mon cahier de manip, mais je ne pense pas avoir depasse les 100-200 ng de template. Le rendement est pas si mauvais en PCR une seule amorce (d'ailleurs est ce qu'on peut encore parler de PCR?)

A+

J'essayerais

Oui je dirais qu'on peut toujours appeler ça PCR, c'est toujours une reaction en chaine par une polymérase (pas exponentielle par contre mais linéaire.)

[mantOs]

Re
Je vous re solicite car bon à moins que je passe à coté de qqchose, j'ai tenté pas mal de conditions, si vous avez THE technique dites là moi !!!! ;o)

Merci

P

[thejohnou]

Salut!
Tout d'abord désolé mais je ne connais pas de technique qui pourrait t'aider. Cependant à ta place je ferais la chose suivante:
tape "purify ssDNA" ou "purification ssDNA" ou toute autre entrée judicieuse à tes yeux dans pubmed, il sort un certain nombre de papiers qui étudient du ssDNA pour telle ou telle raison, il y a donc des chances que tu trouves des idées pour la purification dans la partie "matériels et méthodes". Certains articles ont pour titre explicite la purification du ssDNA, je gage que tu trouve au moins une piste!
Bon courage!

[mantOs]

Salut!
Tout d'abord désolé mais je ne connais pas de technique qui pourrait t'aider. Cependant à ta place je ferais la chose suivante:
tape "purify ssDNA" ou "purification ssDNA" ou toute autre entrée judicieuse à tes yeux dans pubmed, il sort un certain nombre de papiers qui étudient du ssDNA pour telle ou telle raison, il y a donc des chances que tu trouves des idées pour la purification dans la partie "matériels et méthodes". Certains articles ont pour titre explicite la purification du ssDNA, je gage que tu trouve au moins une piste!
Bon courage!

Effectivement c'est une étape que j'ai franchie avant de venir ici
J'ai pas mal de piste venant de pubmed and co m'ayant permis d'avoir les résultats exposés ici.

Ce qu'on ne trouve pas sur pubmed c'est les recettes "maisons" faites par tout un chacun qui sont souvent super efficace et c'est ça que je recherche si jamais quelqu'un est passé par ma galère

[gorben]

salut,

tu as fais combien de cycle pour ta pcr?

A+

[mantOs]

J'ai testé : 20 30 40 et 60 cycles.

[gorben]

perso j'avais fait 99 cycles (n'y voit aucune optimisation precise, c'etait la limite de mon thermocycleur ), avec une polymerase tres resistante a la chaleur et un rajout d'enzyme vers 60 cycles.

A+

[doubleD]

Salut

pas eu le temps de te le dire, donc j'écris ici.

Peut être que tu peux cloner ta séquence dans le pGEMT ( ou le easy) et te servir ensuite de l'origine de réplication du phage f1 qu'il y a dedans.le ssDNA est exporté encapsidé dans le surnageant de culture et il est pur.

C'est fait pour, je pense que tu aurais de bonnes quantités.

[mantOs]

Salut

pas eu le temps de te le dire, donc j'écris ici.

Peut être que tu peux cloner ta séquence dans le pGEMT ( ou le easy) et te servir ensuite de l'origine de réplication du phage f1 qu'il y a dedans.le ssDNA est exporté encapsidé dans le surnageant de culture et il est pur.

C'est fait pour, je pense que tu aurais de bonnes quantités.

Je te vois demain, j'en ai entendu parlé today sur de la biblio.
La technique de purif derrière change mais ca peut peut etre le faire.
Merci