designer mes oligos

[invitef236d683]

Bonjour à tous,

Peut être parmi l'un d'entre vous il y aurait qqn qui pourrait me guider pr le design de mes primers.
Dans mes travaux je veux verifier l'expression d'un gene à la fois chez l'homme et chez la souris, pour cela j'aimerai utiliser des primers qui reconnaissent à la fois la séquence de l'homme et de la souris. J'ai donc utilisé Blast pour trouver les segments communs puis a partir de ca av light cycler probe design j'ai trouvé mes primers mais pr le moment aucun d'entre eux n'a fonctionné.
Auriez vous une autre methode pour designer des primers communs à la souris et a l'homme?

Merci
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[invite899b80e1]

Personnellement je ne connaît pas av light cycler probe design. Mais moi, je fait ainsi pour dessiner mes amorces in silico:

Tout d'abord, je suppose que tu as aligné tes (deux?) séquences par clustalx ou w, histoire de vérifiée s'il existe des zones de similitude nucléique. N'hésite pas a faire tout les sens possible reverse, inverse , reverse inverse. En effet les logiciel disponible en ligne ne tourne pas toujours les brins dans tout les sens immaginable ce qui a pour conséquence de faire varier ton pourcentage de similitude entre deux séquence. Un fois réaliser je réqlise un consensus à l'aide de ce site : http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/.
Il te permet de faire un consensus en utilisant le code IUPAC. Tu peux meme dessiner directement des couples d'amorces avec ce site. Tu configure le GC%, la taille de l'amplicon etc.. Bref il est assez efficace. TU peux néanmoins dessiner tes amorces en utilisant la séquence consensus générer dans le site de primer3:
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

Il est ensuite imporant de blaster tes amorces, ton amplicon pour vérifier la spécificité de ta PCR. Tu peux aussi rechercher si tes amorces amplifie quelque chose in silico à l'aide du sites :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/pr..._LOC=BlastHome

Quand c'est fait tu n'a plus qu'a commander et a tester tes amorces.

Bon courage ,

Will

[piwi]

Ce que je ferais c'est un primer blast contre une banque de transcrits murins ou humain. Là on a on a une liste de primers qui doivent fonctionner au moins dans cette espèce. Ensuite, dans un second temps, je blasterais les primers contre la banque de transcrits de l'autre espèce. Là dedans je choisirais ceux qui sont correctes dans les deux espèces.

Cordialement,
piwi

[invite94612525]

Salut,
a mon avis, il ne faut pas systématiquement utiliser les programmes de "probe design", surtout quand on ne sait pas bien comment ils fonctionnent. Un simple alignement pour repérer les endroits conservées devrait suffire pour faire une amorce "a la main"avec des règles simple (Tm= 4 GC + 2 AT> 62 d) pas trop de dégénerescence surtout en 3'... et regarder si les primers ne font pas de dimers entre eux

[A voir en vidéo sur Futura]