problème extaction ARN

[invited9d9c11e]

Bonjour à tous,
j'ai un problème avec mes extractions d'ARN, quelque soit la méthode que j'utilise (Trizol ou colonne), je n'arrive pas à avoir un ratio A260/A280 superieur à 1,55. Le ratio A260/A230 est lui toujours correct et les concentrations que j'obtiens sont satisfaisantes mais ce ****** de ratio me rend dingue je comprends pas ce que je fais mal...
Si le ratio est trop bas c'est que je suis contaminée avec des prot, non? Est ce que ça peut poser de réel problème au niveau des RT et des QPCR que je fais par la suite?
J'ai déjà fais des RT avec des ARN qui n'étaient pas très beau et ça a marché mais là j'essaye d'eteidre l'expression d'un gène et je n'arrive pas à reproduire mes résultats de QPCR, je me demandais si ça pouvais venir de mes ARN...
Si quelqu'un a une idée, une suggestion, n'importe quoi...
MERCI
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[piwi]

Bonjour,

Quel est le ratio tissu (mg)/trizol (ml)? En un mot vous mettez combien de tissu (quel tissu?) et combien de trizol?

Cordialement,
piwi

[invited9d9c11e]

je travaille sur des cellules cancéreuses, je met 500 µL de Trizol pour un puits de P6 confluent soit environ 1 million de cellules

[piwi]

A mon avis, votre problème vient de là. Plus vous metterez de trizol, plus vous parviendrez à extraire proprement vos ARN. Tentez déjà de mettre 1ml, ça devrait déjà aller mieux.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited9d9c11e]

Mais j'ai déjà travaillé avec moins de cellules et j'ai toujours eu le meme problème et ma chef qui fait comme moi (enfin c'est plutot moi qui fait comme elle) obtient des ratio tout à fait correct.
Enfin j'essaierai quand meme pour la prochaine extraction!! Merci piwi!
Mais sinon la qualité de mes ARN peut elle influer sur mes futures QPCR?