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Exo enzymes de restrictions, un truc m'échappe...



  1. #1
    descmarc

    Exo enzymes de restrictions, un truc m'échappe...


    ------

    Bonjour

    deux souches de E coli. Une étant Dam+ et l'autre Dam-

    Dam est une méthylase qui transfère un groupe méthyle sur la A de la séquence GATC.

    Dans chacune de ces souches ont introduit un plasmide. Après croissance de la souche ont purifie le plasmide et ont le soumet à une digestion enzymatique avec Xba1 dont le site de restriction est TCTAGA ( site de coupure entre le 1er T et le C ).

    Après digestion on fait migrer l'ADN digéré sur gel d'agarose.

    4 bandes apparaissent pour le plasmide de la souche Dam-
    3 bande apparaissent pour le plasmide de la souche Dam+

    La question est: L'enzyme de restriction Xba1 est-elle sensible à la méthylation?

    Evidemment le plasmide de la souche Dam- n'a pas été méthylé ont conclue donc que le plasmide posséde 4 sites de restriction à l'enzyme.

    La ou quelque chose m'échappe c'est que le site de méthylation GATC existe entièrement dans le site de restriction TCTAGA donc chaque sites de restrictions à du être méthylé.
    Si l'enzyme est sensible ont aurait du voir sur le gel 1 bande correspondant au plasmide entier superenroulé.
    Si l'enzyme est insensible on aurait du voir 4 bande identique a celle de la souche Dam-.

    Or ont a 3 bande 2 identiques à la conditions Dam- et une autre propre à Dam+.


    Dans la correction (que je ne comprend absolument pas !) on explique que il y a un chevauchement possible entre le site Xba1 et Dam si le site est précédé de GA ou suivi de TC et que donc la proba pour chaque base étant 1/4 la combinaison résultante est 1/16 (ok !) est donc un site Xba1 sur 4 sera touché par la méthylation !!!!!!!!!!!!
    Donc sur les 4 sites existant un à été méthylé et comme on ne voit que 3 bande ont en conclue que l'enzyme est sensible.

    Ce que je ne pige pas du tout c'est cette histoire de chevauchement en quoi c'est important puisque je répéte, le site de méthylation étant entiérement inclue dans le site de restriction TOUT les site de restriction auraient du être méthylé et l'enzyme n'aurait rien du coupé.

    Voila si quelqu'un comprend quelque chose est peux m'expliquer ce qui m'échappe je lui en serai reconnaissant

    Merci d'avance

    -----

  2. #2
    Zellus

    Re : exo enzymes de restrictions un truc m'échappe...

    Salut,

    Dam a pour substrat la séquence GATC orientée dans le sens 5'-3'. Or dans la séquence TCTAGA elle est orientée de 3' vers 5' ...

  3. #3
    descmarc

    Re : exo enzymes de restrictions un truc m'échappe...

    okkkkkkk

    j'avais fini par trouver cette explication aussi....
    merci dans tout les cas zellus

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