ARN contaminé par de l'ADNgénomique

[invitecc7146d2]

Bonjour à tous,
petit problème de manip.j'extrais de l'ARN végétal afin de réaliser des manip. de RT-PCR. j'utilise pour cela le kit RNeasy de qiagen le problème est que lorsque j'envoie mes clones à séquencer je ne reçois pas des séquences d'ADNc attendues mais des séquences similaires à celles d'ADNgénéomique répertoriées dans les banques... j'ai donc lancé une PCR sur mes ARN avec des amorces de l'actine et effectivement une belle bande apparait en electrophorèse.
mon dernier essai a été de purifier l'ARN avec le kit RNeasy + une DNase fournie avec le kit mais toujours une bande après PCR avec les amorces de l'actine..
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[Yoyo]

Bonsoir,

tu ne dois pas etre dans les bonnes conditions pour que la DNAse agisse. as tu du Mg2+ dans tes tampons?
Sinon pourquoi l'actine devrait etre absente elle ne s'exprime pas dans tes cellules?

Sinon un bon moyen (si tu peux) est de purifier les ARNpolyA+ tu devrais significativement diminuer ta contamination par de l'ADNg.

Yoyo

[invite070ab2d4]

Il n'y a pas de DNase fournie avec le kit RN-easy
Nous utilisons le kit de Promega, il y a une DNase dedans, et nous n'avons jamais eu de problème en Q-RT-PCR

[gorben]

Salut

Le kit de qiagen permet est trés bien à condition que tu ne charges pas trop la colonne. Pour la QRT, j'utilise max 10⁹ cellules (bacteries) et je fais un traitement directement sur la colonne avec la turbo DNA free de invitrogen. Dans ces conditions, pas de contaminants ADN.

Si j'augmente le nombre de cellules je me retrouve contaminé avec de l'ADN. Si je me souviens bien, ils disent dans le protocole que la colonne peut fixer 100µg d'ARN. C'est vrai, mais à condition que tu ais un extrait sans ADN ou trés peu contaminé. Qd je veux des grosses quantitées d'ARN, je fais des extractions trizol sur de grandes quantité de cellules, je degrade mon ADN puis je passe le tout sur colonne qiagen pour concentrer les ARNs (avec traitement turboDNA free).

En gros, diminue ta quantitée de cellules sur la colonne, ton traitement DNase sera plus efficace.

Attention aussi que ta DNase soit bien adaptée, ne prends pas une DNaseI par exemple.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

bonsoir,

p'tite fleur faut relire plus doucement le premier message
Il y a une DNAse mais qui semble ne pas etre totalement efficace. D'ailleurs méfiance quant à l'inactivation de celle-ci avant de faire la RT... sinon problemes en perspectives.

Yoyo

[invite070ab2d4]

Je suis d'accord avec Gorben, souvent augmenter le volume de tampon d'extraction au départ par rapport à la masse de tissus à extraire aide en cas de problèmes divers.

Yoyo, j'utilise aussi le kit Qiagen, ce que je dis c'est que la DNase n'est pas inclue dans le kit. Il est dit dans le protocole qu'on peut à tel moment faire une DNase mais il faut l'acheter à part.

[Yoyo]

Ah ok, désolé j'avais pas compris ton premier message

yoyo

[invitecc7146d2]

merci à tous, pour répondre à Yoyo l'actine s'exprime bien dans mes cellules mais sachant que la PCR n'agit que sur les ADN (avec une Taq polymérase classique biensur je ne parle pas de RT) lorsque je lance une PCR avec les amorces de l'actine sur mon ARn je en devrai rien obtenir et pourtant j'ai une bande donc il y à de l'ADN...
J'ai également essayé de moins charger ma colonne en tissu de départ, à savoir du végétal, jusque là je dépassais les 100mg de tissu préconisés par qiagen (j'allais jusqu'à 500mg). En effet en diminuant la quantité de tissu et en laissant agir la DNase un pae plus longtemps (1h au lieu d'un quart d'h), je n'ai plus d'ANDgénomique! le seul problème est que je n'ai plus assez d'ARN non plus!!! je vais maintenant tenter de faire agir la DNase après purification des ARNs, en milieu liquide et non dans la colonne, je vous donne les résultats demain...
Au fait c'est bien une DNase I que vend qiagen pour utiliser avec le kit RNeasy, qu'elle est le problème de la DNase I?
Merci encore pour tous vos conseils

[Yoyo]

Bonsoir

Attention de nombreuses TAQ polymerases ont des activités RT!!! celle d'amersham par exemple marche tellement bien qu'il n'y a meme pas besoin de rajouter de la rt-polymerase pour reverse transcrire

Une facon de voir si ton ampli proviens de l'adn ou de l'ARN, est de traiter une fraction de ta purif a la RNAse... si tu n'amplifies plus rien c'est que ta bande provenait bien de tes ARN. Les RNAses marchent tellement bien qu'il n'est pas envisageable qu'il reste des ARN intacts.

Yoyo

[gorben]

J'ai également essayé de moins charger ma colonne en tissu de départ, à savoir du végétal, jusque là je dépassais les 100mg de tissu préconisés par qiagen (j'allais jusqu'à 500mg). En effet en diminuant la quantité de tissu et en laissant agir la DNase un pae plus longtemps (1h au lieu d'un quart d'h), je n'ai plus d'ANDgénomique! le seul problème est que je n'ai plus assez d'ARN non plus!!! je vais maintenant tenter de faire agir la DNase après purification des ARNs, en milieu liquide et non dans la colonne, je vous donne les résultats demain...

Tu peux aussi pooler plusieurs colonnes sur une colonne pour concentrer ton ARN.

Au fait c'est bien une DNase I que vend qiagen pour utiliser avec le kit RNeasy, qu'elle est le problème de la DNase I?

Bcp de DNase I ont des activitées moderées sur l'ADN c'est pour ca qu'elles sont utilisées pour faire du footprint. Elles ne sont donc pas toutes trés bonnes pour ce que tu veux faire. J'ai tésté le kit Qiagen et sa DNase n'etait pas terrible, c'est pour ca que j'en ai changé.

[invitecc7146d2]

en traitant mon ARN en milieu liquide direct après purification puis en faisant un Clean up derrière je n'ai plus de contaminantion et même si j'ai une perte d'ARN elle n'est pas énorme (1 semaine pour résoudre ce problème!!!)

[invitef816fdcb]

Un kit qui marche très bien avec le végétal (i,e. Arabidopsis) commercialisé par Macherey-Nagel (moins cher que Qiagen !) et tu as aussi l'ADNase fourni avec !

[invitecc7146d2]

Un kit qui marche très bien avec le végétal (i,e. Arabidopsis) commercialisé par Macherey-Nagel (moins cher que Qiagen !) et tu as aussi l'ADNase fourni avec !

Merci je ne le connaissais pas je télécharge de suite la doc

[invite2936c094]

Bonjour,

Je viens de rechercher sur le net des explications sur la contamination ADN que j'obtiens en réalisant mes extractions ARN et je suis tombée sur le forum de futura science où en janvier 2003 yoyo indiquait qu'il y a certaines taq qui peuvent reverse transcrire de l'ARN.

J'ai réalisé un traitement DNase de mes ARN lors de l'extraction ARN mais lorsque j'essaie d'amplifier mes ADNc avec des primers se trouvant dans le promoteur de mon plasmide ou à l'extérieur de mon ORF (après le teminateur et dans le promoteur), je sort toujours quelque chose, or je ne devrait pas puisque je recherche des ARNm (RT avec oligodT) qui, si mes souvenirs sont les bons, correspondent uniquement à l'ORF (ATG au STOP).

J'ai alors suivi votre conseil: j'ai RNasés mes ARN DNasés et j'ai réalisé une PCR directement sur cette condition, je n'ai rien obtenu.

Lorsque j'ai refait le test, j'ai testé en même temps sur des ARN DNasés, des ARN DNasés RNasés et des ARN non DNasés RNasés , voici les résultats de PCR sur ARN avec des primers toujours dans le promoteur:

DNasé NON RNasé : amplification dûe à la Taq?


DNasé + RNasé : rien

Non DNasé + RNasé: amplification, il reste donc de l'ADN après mon extraction ARN.

J'ai alors testé avec une Taq haute fidélité et les résultats sont identiques!!

Quelle Taq pourrait me donner une réponse clair?
J'ai prévu de refaire des tests avec des souches ne possédant pas de plasmide et de rajouter une quantité de plasmide en DNasant ou non les extractions.

Si vous avez une explication sur ces résultats merci de me tenir au courant, je commence un peu à m'arracher les cheveux...