compter des cellules/marquer de l'ADN/transgenese

[invitefec9ebe8]

Bonjour à tous

Je rédige en ce moment un article scientifique dans lequel je dois décrire une expérience de mon invention.
j'ai choisi de faire une transgenese sur un animal (le porc). je n'ai aucune contrainte puisque cette expérience ne sera pas réalisée mais je dois en décrire le mode opératoire et inventer les résultats.

Mais Il me manque quelques éléments :
-quelle méthode utiliser pour compter le nombre de cellules dans une culture à différents temps?
- lors de l'introduction du transgène dans le génome de ma cellule souche grace a un plasmide comment faire pour savoir sur quel chromosome s'est insérer le gène?

merci d'avance pour vos réponses
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[invite9e6bc039]

Bonjour à tous

Je rédige en ce moment un article scientifique dans lequel je dois décrire une expérience de mon invention.
j'ai choisi de faire une transgenese sur un animal (le porc). je n'ai aucune contrainte puisque cette expérience ne sera pas réalisée mais je dois en décrire le mode opératoire et inventer les résultats.

Mais Il me manque quelques éléments :
-quelle méthode utiliser pour compter le nombre de cellules dans une culture à différents temps?
- lors de l'introduction du transgène dans le génome de ma cellule souche grace a un plasmide comment faire pour savoir sur quel chromosome s'est insérer le gène?

merci d'avance pour vos réponses

C'est du beau



Les cellules tu les comptes directement au microscope avec une lame échelonnée.
Sinon savoir sur quel chromosome ton fragment s'est inséré, c'est une autre histoire.
Normalement l'insertion se fait par recombinaison homologue, donc tu connais déjà la séquence visée.Si c'est pas le cas t'as plusieurs solutions, perso je ferais une PCR inverse.

http://www.icampus.ucl.ac.be/ANIBIOL...nversepcr.html

[Vinc]

Salut!
Si tu veux compter les cellules de manière plus précise, tu peux faire de la cyto en flux!
A+
Vinc

[invitefec9ebe8]

merci pour vos réponses

oui je sais que c'est pas top d'inventer de résultats mais ce sont les consignes en réalité il vaut mieux que j'invente parce que j'ai pas vraiment le matériel pour faire une transgenèse sur des cellules ES de porc...

Normalement l'insertion se fait par recombinaison homologue, donc tu connais déjà la séquence visée.Si c'est pas le cas t'as plusieurs solutions, perso je ferais une PCR inverse.

mon transgène ne peut pas sintégrer par recombinaison homologue vu que c'est un gène totallement étranger au porc.

Si tu veux compter les cellules de manière plus précise, tu peux faire de la cyto en flux!

c'est quoi une cyto en flux?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Vinc]

Salut!

c'est quoi une cyto en flux?

La cytométrie en flux est une technique qui permet de faire pas mal de choses en biologie cellulaire et moléculaire!

Pour faire simple, c'est une machine qui fait passer tes cellules une à une dans un espèce de petit canal dans lequel circule tes cellules en solution : cela revient à faire circuler tes cellules les une dérrière les autres dans un flux de liquide!
Les cellules vont passer devant quelque chose que l'on va apeller grossièrement un récepteur (un peu comme les radars de la police si tu vois ce que je veux dire! ) qui va mesurer la taille de ta cellule, qui va compter le nombre de cellules et qui peut également mesurer une fluorescence sur ta cellule (si tu as fait une construction à la GFP par exemple!)! Ensuite, la bécane peut même te trier tes cellules pour les diviser en groupes à la sortie de l'appareil selon des critères que tu auras fixé!

A+
Vinc

[Vinc]

J'ai oublié de répondre à ca!

mon transgène ne peut pas sintégrer par recombinaison homologue vu que c'est un gène totallement étranger au porc.

C'est pas grâve, tu peux quand même faire de la recombinaison homologue il me semble!
Il te suffit de faire une construction dans laquelle tu encadres ton ADN d'intérêt, par 2 séquences présentes chez le porc! Tu auras une recombinaison homologue et une insertion site spécifique entre ces 2 séquences sur le génome de ta bestiole! Ca se passe par linéarisation interne ou externe, à savoir qu'une linéarisation externe est mieux pour la stabilité qu'une linéarisation interne (car dans ce dernier cas tu peux de nouveau avoir des recombinaisons homologues après ton insertion!)....
Bien sûr tu mets ton insert sous contrôle d'un promoteur fort, et le tour est joué!

A+
Vinc

[invitefec9ebe8]

Merci beaucoup
je dois avouer que je débute un peu en bio cell ça parait simple quand on y pense, qu'on voit des cours, des bouquins mais dans les détails c'est vraiment mais alors VRAIMENT PAS simple
je viens de découvrir ce site et c'est vraiment une chance

[invitefec9ebe8]

Heu j'ai oublié qqch

Il te suffit de faire une construction dans laquelle tu encadres ton ADN d'intérêt, par 2 séquences présentes chez le porc! Tu auras une recombinaison homologue et une insertion site spécifique entre ces 2 séquences sur le génome de ta bestiole

La construction en question, je peux l'intègrer dans ma cellule par l'intermédiaire d'un plasmide bactérien?

[Vinc]

Salut

Heu j'ai oublié qqch
La construction en question, je peux l'intègrer dans ma cellule par l'intermédiaire d'un plasmide bactérien?

Normalement oui, mais il faudra que tu linéarises si ton plasmide est circulaire! Il ya peut-être des protocolles où tu n'as pas besoin de linéariser mais je ne les connais pas!
Donc concrêtement, tu coupes ton plasmide circulaire grâce à un site de restriction et tu obtient ton plasmide sous forme linéaire qui peut ensuite s'insérer par recombinaison homologue!

A+
Vinc

[Yoyo]

Bonsoir,

Il me semble que la grande majorité (totalité) des cellules d'eucaryotes superieurs ne font pas de recombinaison homologue, mais de la recombinaison hétérologue dans laquelle aucune homologie de sequence n'est necessaire.
Ceci pose d'ailleurs des problemes en thérapie génique, a cause de l'integration aléatoire du transgene.

En revanche la levure (S. cerevisiae) fait au contraire 99% de recombinaison homologue ce qui est tres tres tres pratique pour cibler l'intégration!

Yoyo

[Vinc]

Oups.....
J'étais parti chez la levure!
Mais quelle idée de vouloir transfecter des cellules de porc aussi....

[invite9e6bc039]

Bonsoir,

Il me semble que la grande majorité (totalité) des cellules d'eucaryotes superieurs ne font pas de recombinaison homologue, mais de la recombinaison hétérologue dans laquelle aucune homologie de sequence n'est necessaire.
Ceci pose d'ailleurs des problemes en thérapie génique, a cause de l'integration aléatoire du transgene.

En revanche la levure (S. cerevisiae) fait au contraire 99% de recombinaison homologue ce qui est tres tres tres pratique pour cibler l'intégration!

Yoyo

Hello
Non non, en cellule ES c'est bien de la recombinaison homologue (c'est de cette manière qu'on peut faire des Knock-out et knock-in )

La thérapie génique est totalement différente étant donné qu'elle est médiée par un virus (dans le cas des échecs observés à Paris).

Pour résumer, la transgénèse se fait sur cellules ES par Rec. Hom. , on sreen plusieurs centaines de clones (vérifie l'intégration par PCR) et on injecte l'embryon au stade de morulla, ensuite il faut prier pour que la lignée germinale soit "touchée", sélectionner une descendance positive et refaire une croisement si nécessaire (s'il est hétérozygote). Ceci paraît compliqué, mais pour l'instant on n'a pas d'alternative

[Yoyo]

Non non, en cellule ES c'est bien de la recombinaison homologue (c'est de cette manière qu'on peut faire des Knock-out et knock-in

Il me semblait que ces systemes de recombinaisons "homologue" mettaient en jeu une cassure double brin induite par une meganuclease ou une enzyme apparentée non?
Dans tes cellules ES, tu transfectes simplement un fragment avec des extremités homologue et ca recombine? ou tu dois induire la recombinaison ?

Yoyo

[Vinc]

Salut!

Hello
Non non, en cellule ES c'est bien de la recombinaison homologue (c'est de cette manière qu'on peut faire des Knock-out et knock-in )

Pour faire du KO, c'est pas plus simple d'utiliser des sites LoxP et la recombinase (système Cre/Lox)???

[invite9e6bc039]

Salut!



Pour faire du KO, c'est pas plus simple d'utiliser des sites LoxP et la recombinase (système Cre/Lox)???

Nan, ça c'est pour des KO inductibles si ta délétion est létale

[invite9e6bc039]

Il me semblait que ces systemes de recombinaisons "homologue" mettaient en jeu une cassure double brin induite par une meganuclease ou une enzyme apparentée non?
Dans tes cellules ES, tu transfectes simplement un fragment avec des extremités homologue et ca recombine? ou tu dois induire la recombinaison ?

Yoyo

Les deux existent

La 2eme solution étant évidemment la plus efficace, mais pas forcémment la plus simple.

[piwi]

notez bien que l'on a les cellules souches (ES) que chez la souris....
Donc pour faire de la recombinaison homologue chez le porc c'est loupé. M'enfin c'est un exercice théorique.
Ensuite on peut faire de la trangénèse aléatoire. On ne sait pas combien de copies s'intègrent ni où mais c'est deja plus simple que la recombinaison homologue.

Enfin se demander si faire un LoxP/cre est plus simple est curieux. Plus tu compliques le système plus tu te prends la tête avec des problèmes de clonages, de système qui bugue, de cre qui "fuit" (excise quand où la elle ne devrait pas). Donc non c'est pas plus simple. En plus le système cre/lox n'a d'interet que si tu veux exciser ta sequence à un stade precis ou dans un tissu precis.

[Vinc]

Salut!

En plus le système cre/lox n'a d'interet que si tu veux exciser ta sequence à un stade precis ou dans un tissu precis.

Ba oui mais si tu fait exprimer ta recombinase dans tous les tissus, tu peux avoir du KO sur toutes les cellules...

[invite9e6bc039]

Salut!


Ba oui mais si tu fait exprimer ta recombinase dans tous les tissus, tu peux avoir du KO sur toutes les cellules...

Pour un KO "permanent" on ne "lox" pas son locus, c'est inutile

Encore une fois poue des raisons pratiques... tu peux très bien imaginer une flipase thermosensible dont le promoteur est induit par la GFP, elle-même couplée à p53 et induire ton KO après exposition aux UV

Mais à la paillasse, on va toujours au plus simple.

[Vinc]

Encore une fois poue des raisons pratiques... tu peux très bien imaginer une flipase thermosensible dont le promoteur est induit par la GFP, elle-même couplée à p53 et induire ton KO après exposition aux UV

Oui j'ai souvent tendance à me compliquer la vie mais la solution que tu me proposes ici me plait bien!!!

Mais bon, je trouve pas que ce soit si tordu que ça de faire du Cre/lox pour avoir un KO permanent..... , mais bien sûr c'est mieux si c'est pour faire un KO tissu spécifique.....

[piwi]

oui mais si tu ne la mets pas tu as un ko dans toutes les cellules.
C'est la technique de base

[invitefec9ebe8]

posté par piwi

notez bien que l'on a les cellules souches (ES) que chez la souris....
Donc pour faire de la recombinaison homologue chez le porc c'est loupé. M'enfin c'est un exercice théorique.
Ensuite on peut faire de la trangénèse aléatoire. On ne sait pas combien de copies s'intègrent ni où mais c'est deja plus simple que la recombinaison homologue.

mes expériences ne sont qu'imaginaires donc pas de problème j'ai accès à des cellules ES de porcs
(c'est juste un entrainement à la rédaction d'article scientifique mais j'avoue que ça fait pas très scientifique justement.)

Merci à tous pour vos réponses même si j'ai pas tout compris à votre histoire de système Cre/Lox