Concentration d'un produit PCR

[boschetto]

Bonjour, dans le cadre d'un clivage j'aurais besoin de savoir quelle est à peu près la concentration en µg/µl d'un produit PCR en général.

Merci.
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[invite899b80e1]

ca depend de l'intensité de la bande, en général tu peu t'aider du marqueur de poids moléculaire. ca te donnera une idée de ta concentration.

[Flyingbike]

"en général" ça n'existe pas en PCR... tu peux obtenir quelques nanogrammes à quelques grammes..

[boschetto]

Le problème est que je ne dispose pas d'étalon de concentration connue, par rapport auquel comparer l'intensité lumineuse.

Le marqueur que j'utilise ne renseigne pas la quantité par bande.

[A voir en vidéo sur Futura]

[kamor]

C'est bizarre ça qu'il ne renseigne pas la concentration.
Dans ce cas, sers toi de la spectrophotométrie 260/280 nm pour doser ton échantillon.

[invite30157012]

Salut
Oui c'est ce que j'allais dire une petite mesure de DO te permettra te connaître ta concentration! (plus exactement à 260 nm). 260/280 étant le ratio pour la conta protéique.

[invitef08e6467]

Salut,

On peut avoir une concentration à partir de la bande du produit PCR??? uhuh dire qu'on m'a toujours répété que la PCR n'était pas quantitative... Je pense que ça doit être loin d'être précis la lecture de l'intensité de la bande... le BET ne se fixe pas de la même façon sur tous les produits...

J'opterais pour la DO à 260 nm moi aussi... Même si tu n'es pas super précis tu auras une bonne idée de ta quantité d'ADN.

[kamor]

Oui on peut doser à partir d'un gel d'électrophorèse, en faisant des comparaisons de fluorescence (en gros on sélectionne une bande témoin ou on lui dit "il y a tant" et il peut estimer la quantité d'ADN dans notre bande). Après c'est un jeu : il faut bien sélectionner sa bande, avoir un gel "propre", etc... Et la précision n'est pas super.

Mais ce n'est pas vraiment quantitatif au sens de la qPCR, car on ne peut que mesurer le produit, on ne peut déterminer la quantité initiale.

Attention aussi, il faut que tu n'aies qu'un amplicon pour faire le dosage par spectrophotométrie, sinon tu quantifieras tout l'ADN.
Mais il existe des kits te permettant d'extraire l'ADN à partir d'un gel quand même.

[inviteb94d8e21]

Bonjour,

La spectro à 260/280 ne me parait pas la méthode de choix pour quantifier un produit de PCR. En effet, avec un coefficient d'extinction de 50ug/ml pour 1 DO et des volumes de cuve rarement inférieurs à 300ul, il faut que disposer de quelques ug d'ADN (au moins) pour que la mesure soit fiable. Je conseille plutôt l'utilisation d'un fluorimètre type "nanodrop".
La comparaison de l'intensité des bandes en BEt ou en SYBRSafe donne de bons résultats, à un facteur 2 près... Il faut avoir un standard, n'importe quel plasmide linéarisé dont la concentration est connue fait l'affaire. Il est prudent de faire une gamme de dilution du standard (entre 10ng et 500 ng) pour évaluer plus finement la concentration de l'échantillon. Si l'échantillon est trop concentré (la saturation au BEt commence vers 500ng), il faut le diluer.

[kamor]

Bonjour,

La spectro à 260/280 ne me parait pas la méthode de choix pour quantifier un produit de PCR. En effet, avec un coefficient d'extinction de 50ug/ml pour 1 DO et des volumes de cuve rarement inférieurs à 300ul, il faut que disposer de quelques ug d'ADN (au moins) pour que la mesure soit fiable.

Ah bon?
J'utilise des uvettes, cuve jetable, qui fonctionnent très bien avec 50 µl. De plus 50µg/ml = 50ng/µl et ça fonctionne très bien avec quelques ng.
Et la précédente cuve quartz que j'utilisais, par contre j'en avais qu'une vu le prix et je devais la nettoyer entre chaque lecture, nécessitait un volume de 100µL.
Cette technique sert surtout à doser la concentration après extraction. C'est souvent ce même ADN qu'ensuite on utilise en PCR, donc on le multiplie de façon exponentielle

[inviteb94d8e21]

Ah bon?
J'utilise des uvettes, cuve jetable, qui fonctionnent très bien avec 50 µl. De plus 50µg/ml = 50ng/µl et ça fonctionne très bien avec quelques ng.
Et la précédente cuve quartz que j'utilisais, par contre j'en avais qu'une vu le prix et je devais la nettoyer entre chaque lecture, nécessitait un volume de 100µL.
Cette technique sert surtout à doser la concentration après extraction. C'est souvent ce même ADN qu'ensuite on utilise en PCR, donc on le multiplie de façon exponentielle

Ben oui, 50ng/ml dans 50ul, ça fait tout de même 2.5ug... même si l'on se contente d'une DO de 0.2, il faut 500ng dans 50 ul (après purification du produit de PCR pour ne pas mesurer les nucléotides non incorporés). C'est jouable mais c'est limite... Je préfère la fluorimétrie.
Je ne connaissais pas les micro-cuves transparentes aux UV, merci pour le tuyau.

[invite30157012]

Bonjour
Peut-être qu'un élément m'échappe mais j'utilise aussi un nanodrop ce qui est en effet très pratique mais d'après moi on l'utilise aussi comme un spectrophotomètre sauf que sur un tout petit volume (1-2 µL) et dans une très petite colonne avec une mesure sur 1mm il me semble. Bref il n'en reste pas moins que c'est une mesure de DO à 260 qui est faite, enfin il me semble. Donc je ne vois pas le rapport avec de la fluorimétrie...!? (même si cet appareil peut aussi servir pour de la fluo)

[kamor]

Ben oui, 50ng/ml dans 50ul, ça fait tout de même 2.5ug... même si l'on se contente d'une DO de 0.2, il faut 500ng dans 50 ul (après purification du produit de PCR pour ne pas mesurer les nucléotides non incorporés). C'est jouable mais c'est limite... Je préfère la fluorimétrie.
Je ne connaissais pas les micro-cuves transparentes aux UV, merci pour le tuyau.

Après extraction par kit, je tourne souvent autour de 0.3, après une dilution au 1/8 et mon éluat fait 100µl. Ca correspond donc à... 12µg si mon calcul rapide ne me trompe pas. Je dois avouer que je me suis jamais amusé à quantifier l'ADN après PCR mais on doit quand même avoir une jolie petite quantité.

Par contre je suis d'accord, la fluorimétrie même sans nanodrop sera plus précise. C'est la seule fois ou mon coefficient de régression était de 1.

[inviteb94d8e21]

Bonjour
Peut-être qu'un élément m'échappe mais j'utilise aussi un nanodrop ce qui est en effet très pratique mais d'après moi on l'utilise aussi comme un spectrophotomètre sauf que sur un tout petit volume (1-2 µL) et dans une très petite colonne avec une mesure sur 1mm il me semble. Bref il n'en reste pas moins que c'est une mesure de DO à 260 qui est faite, enfin il me semble. Donc je ne vois pas le rapport avec de la fluorimétrie...!? (même si cet appareil peut aussi servir pour de la fluo)

Bonjour,
Il y a plusieurs modèles de nanodrop. Celui utilisable pour la fluorimétrie (modèle 3300) permet de mesurer des concentrations très basses (de l'ordre de 5ng/ml) d'ADN en fluorescence avec le Picogreen.
Les autres modèles sont effectivement des spectros UV pour des échantillons de très faible volume. Leur limite de détection est donc celle d'un spectro UV classique, soit environ 1ug/ml (DO260=0.02).

[invitee6ff9322]

J'ai du également par le passé connaitre la concentration de mes produit de PCR pour pouvoir "creer" des gènes tronqués de certain domaine.
Selon mes fragments amplifiés la quantité que j'avais variait énormement.

Pour déterminer ces concentrations, je me suis tout le temps basé sur les resultat donné par le nanodrop. Comme la suite de mes manips ont fonctionné c'est que mes calcul pour avoir les même concentration des différent fragment était bon et que mon dosage nanodrop aussi était le bon.