Cellules RAW 264.7

[invite9948c247]

salut a tous,
j'étudie en ce moment une publication de 2003 traitant de la régulation réciproque d'LXR (Liver X Receptor) sur le métabolisme des lipides et la réaction inflammatoire.
Il y a une experience pr prouver que LXR agit négativement sur l'expression d' NFkB (facteur de transcription) et ils transfectent transitoirement("transient transfection" dans le texte) pour cela des cellules RAW 264.7 avec deux construction:
-vecteur d'expression avec les gènes LXR/RXR
-vecteur avec promoteur minimal contenant un site de fixation pr NFkB et un gène rapporteur (luciférase)
Pus ils activent LXR en injectant un ligand synthetique.

Questions:
-pourquoi utiliser des cellules RAW 264.7, alors que depus le début de la publi ils utilisaient des macrophages issus du tissu péritonéal??
-pourquoi, si les cellules RAW 264.7 sont des macrophages (d'après ce que j ai pu trouver sur internet), transfecter le gène d'LXR (il devrais déja etre contenu dans le macrophage)

Help!! je dois présenter ma publi la semaine prochaine
Merci
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[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura,

Aaaahhh enfin quelqu'un qui parle des LXRs!

Je connais très bien cette publie qui est majeure dans l'étude de la biologie des LXRs (Joseph et al, Nature Medicine 2003, équipe de Tontonoz).

Comme tu le sais peut-être les macrophages ne se divisent pas. Pour qu'une transfection marche, il faut qu'elle soit faite sur des cellules se divisant puisque cela permet l'entrée du plasmide dans le noyau lorsque la membrane nucléaire se reforme en télophase/cytocinèse. C'est pourquoi ils utilisent les cellules RAW 264.7 (fiche atcc) qui sont des macrophages transformés, et qui peuvent donc se diviser.

Les macrophages expriment en effet les deux types de LXRs. La transfection de l'hétérodimère LXR/RXR a deux avantages :
- Augmenter la réponse induite par les agonistes des LXRs, et ainsi obtenir une détection correcte de l'activité luciférase.
- Connaitre les caractéristiques du cross-talk avec NFkB pour chacun des LXR. En effet, les constructions codant les LXRs sont sous contrôle d'un promoteur CMV (cytomegalovirus) qui va provoquer une surexpression du récepteur. La quantité de LXRs endogènes sera donc négligeable par rapport au LXR exogène apporté par la transfection. Ainsi lors de la transfection du LXRa, on peut considérer que la réponse obtenue est spécifique du LXRa, et inversement pour le LXRb. En parallèle, on transfecte le partenaire obligatoire des LXRs, le RXR. En effet, si cela n'était pas fait, il serait en quantité limitante et annulerait les avantages de la transfection des LXRs cités ci-dessus.

Bon courage,

Greg

[invite9948c247]

Merci beaucoup de ta réponse