Extraction d'ARN pour puce

[invite9ec85a7d]

Bonjour,
j'essaye d'extraire des ARN bactériens à partir d'un nombre restreint de cellules dans une solution qui contient pas mal de proteines. déjà c'est pas très simple d'avoir une quantité suffisante pour puce (10µg), et en plus je viens de les vérifier sur une puce agilent et je me rend compte que la plupart de mes arn extrait sont des 5s??!!! j'ai testé mon extraction sur des cellules cultivés en milieu optimum et c'est pareil, un énorme pic 5S! ma principal méthode d'extraction est phenol/chloroforme, j'ai testé un kit macherel, j'ai eu le m^me pic, avait vous une idée sur ce que peut etre ce pic? des 5S? des ARN degradés???
Merci bien
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[Josquin]

tu essaies d'obtenir des mRNA ? je ne sais pas pourquoi tu as plutôt des 5S que des 18S ou autres (je me souviens jamais les différences entre procaryotes et eucaryotes...), mais de facon générale, dans toute extraction d'ARN, les ribosomiques sont en quantité écrasante par rapport aux autres ARN.

Josquin

[kamor]

Marrant ça (si j'ose dire). La plupart du temps, si on fait un gel controle d'extraction d'ARN, on verra une bande correspondant au 5S, mais aussi celle des 16S. Tu n'en as pas du tout?
Après ça dépend dans quel état physiologique sont tes cellules, les 5S sont souvent considérés comme des gènes constitutifs donc qu'il y en ait toujours est normal.
Je ne sais pas si les ARN 5S de ta bestiole sont considérés plus résistants que les autres ARN, ça serait aussi une hypothèse mais un peu capillotracté quand même

[invite9ec85a7d]

Bonjour,
je vous répond avec bcp de retard, oui je vois mes bandes 16 et 23S,
sur l'état de mes cellules je suis en phase statio.... je suis en train de lire sur la resistance des 5S, mais bon je suis tjrs un peu perdu, parce il sont vraiment en qq écrasante

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Mais vous extrayez vos ARN au phenol/chlo?
Commencez déjà par utiliser du trizol, ça sera sans doute mieux. Ensuite, faites vous une migration sur gel d'un aliquote de votre extrait? Il faut absolument le faire avant d'aller plus loin. Vous verrez l'état de vos ARN, c'est toujours bon à prendre.
Éventuellement, si personne ne peut vous aider dans votre labo, mettez la photo sur le forum que l'on y jette un œil.

Cordialement,
piwi

[invite9ec85a7d]

Bonjour piwi,
oui je fait mes extractions au trizol/chlo, je congele mon culot dans 10 mL de trizol, et le lendemain je lance mon extraction, pour l'instant on m'a proposé 2 pistes, 1-mon volume de trizol est tros important et il prend bcp de temps à decongeler (c'est vrai ca prend une 1/2 à temperature ambiante) et les ARN se dégrade pendant ce temps la (je pensais qu'ils étaient protégés dans le trizol, il parrait que non). donc je vais essayé une extraction en congelant mes culots (sans rien) se qui me fait un peu peur , j'ai deja essayé le RNA latter, mais ca m'a bien compliqué les choses parceque il precipite les proteines.
2ieme piste, le problème viens du fait que je travaille sur des cellules en phases statio, qu'en pensez vous?

[invite9ec85a7d]

désolé , voici le reste du message,
déjà la decongélation prend une demi heure au moins.
pour la photo que j'ai envoyé c'est un gel agilent, on voit bien les 2 bandes 16 et 23S mais (très faible) avec une enorme bande 5S, qu'on je regarde les profiles de dégradation sur le net, ca ne ressemble pas à ce que j'ai, je n'ai pas de smir, voici un profile agilent aussi
Merci!

[piwi]

En gros ce que vous faites c'est que vous culotez vos bactéries, vous mettez du trizol dessus et vous placez le tout au -80°C.
Effectivement, dans ces conditions vos ARN ne seront pas protégés dans la mesure où ils se trouvent dans les cellules. Avec le stress du au trizol, c'est là qu'elles relarguent des RNases bien à l'abri dans le cytoplasme. 1/2h c'est trop long!
Ce qu'il faut faire si vous tenez vraiment à congeler en trizol, c'est lyser vos tissus avant de congeler de sorte à relarguer le contenu cytoplasmique dans la solution. Et là, vos ARN seront protégés.
Sinon, le mieux est de congler le culot à sec puis d'ajouter le trizol juste avant de lyser, sur les cellules encore congelées.

Cordialement,
piwi

[Flyingbike]

je confirme : il vaut mieux congeler a sec, puis ajouter le trizol sur cellules congeler puis lyser tout de suite.
Je fais comme ça : lavage des cellules dans PBS froid, aspiration, boite sur glace, puis au -20 dans du parafilm. Quelques jours après quand je suis motivé pour extraire, j'ajoute sur les cellules sur glace mon trizol et je gratte.

[invite9ec85a7d]

Merci pour vos réponse,
je test la congélation sans trizol, et je vous tiens au courant.
pas de commentaires sur les profiles?

bonne journée!

[invite9ec85a7d]

Bonjour,
j'ai testé de congeler mes culots et de rajouter le trizol lors de la decongélation. puis j'ai suivi le m^me protocole que d'hab, j'ai une le m^me résultat (énorme bande 5S. j'ai aussi tenté de traiter mon culot au lysozyme avant l'extraction et la c'était bon, apparament je ne casser pas suffisament mes cellules (mmm je n'ai pas encore passé mes échantiloons sur agilent, mais le profiles sur gel d'agarose n'est pas mal du tout.

Merci à vous