Extraction d'ARN

[inviteb412111e]

Bonjour à tous,

Je viens de m'inscrire sur ce forum qui m'a l'air tout à fait intéressant. Ma question est la suivante : en fait je travaille actuellement sur des algues brunes et je réalise pas mal d'extraction d'ARN avec le kit Picopure RNA Isolation de chez Arcturus. Mais le problème c'est que l'ARN est souvent assez "sale" à la fin, donc je voudrai savoir si quelqu'un a déjà utilisé le Kit Rneasy Micro de chez Qiagen sur les plantes, et si vos résultats étaient meilleurs ou pas? (car il possède un cleanup en plus). Merci d'avance et bonne journée!!!
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[yoda1234]

Message déplacé dans la section adéquate du forum.

[invite84b0382c]

Bonjour,

Même sans avoir travaillé sur des plantes, je sais que QIAGEN (sans faire de pub hein ) est un très gros fournisseur. Rien ne t'empêche d'en commander une boite ou alors de demander une ou deux colonnes pour faire quelques tests

Si je peux me permettre en quoi ton échantillon est il "sal" ?
L'as tu passé au spectro ?

Akïn

[inviteb412111e]

en fait, j'ai déjà le kit, mais dans le guide d'utilisation, il n'y a pas de chapitre "plantes" donc du coup, je ne savais pas trop quel protocole suivre, finalement je me suis lancée dans tissus, on verra bien!!! Mon échatillon est "sale" car en le passant au nanodrop, j'observe un mauvais résultat car il y a beaucoup de sels, ... Merci en tout cas benjy_star

[A voir en vidéo sur Futura]

[jmbowie]

Tu devrais essayer de te renseigner pour le kit FastRNA pro de MP-Biomedicals: ils ont developper toute une gamme de tubes contenant des billes adaptées à chaque type de tissus/organismes.Il y en a une dizaine. De mon expérience, ca marche pas mal, mais le souci c'est qu'il te faut la machine (FastPrep) qui va avec (quelqu'un en a peut-être un dans ton institution):

Voici le lien, hésite pas à appeler leur service technique, pour savoir quel kit utiliser (pas le bleu j'en suis sûr, peut-être le vert)

http://www.mpbio.com/index.php?cPath=491_375_398

[Annaick_R]

Bonjour,

j'ai toujours utilisé le kit RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) pour extraire les ARN de plantes.
D'ailleurs, c'est le seul recommandé par le fabriquant pour les extractions d'ARN à partir de plantes et de champignons (voir le tableau ici).

D'après ce tableau, le kit RNeasy Micro que tu t'apprête à utiliser convient uniquement aux petits échantillons de cellules ou de tissus. J'ai bien peur que ton kit Picopure RNA Isolation de chez Arcturus soit également optimisé pour les tissus animaux.

Le gros problème avec les algues, ce sont les alginates qui bouchent les colones d'extraction.

Il n'y a personne dans ton labo qui travaille sur les algues et qui aurait un protocole eficace à te passer ?

Annaïck.

[piwi]

Je ne bosse pas sur les plantes mais si vous avez une cochonnerie qui bouche vos colonnes vous pouvez peut être faire une petite centrifugation de votre lysat avant de le passer. Un truc genre 10 minutes à 4000-5000 rpm à 4°C devrait vous débarrasser. On peut aussi noter que les colonnes sont parfois sensibles à la saturation. En réduisant le matériel déposé dessus on augmente parfois considérablement l'efficacité du processus.

Sinon, vous ne pouvez pas broyer avec une sonde turax? Faire une premère extraction au trizol avant de passer sur votre kit?

Notez que je suis peut être à la masse et que tout cela n'est peut être pas possible avec les plantes.

Cordialement,
piwi

[inviteb412111e]

Merci à vous, j'ai essayé le kit Micro de Qiagen, et les résultats sont assez bons, mais je trouve le Picopure de chez Arcturus plus facile d'utilisation et il offre des résultats tout aussi satisfaisants. Nous travaillons sur des très faibles quantités de matériel, ce qui ne nous facilite pas la tâche mais bon, c'est aussi ça la bio, il faut savoir s'adapter à toutes les situations !!! Bonne journée à tous...

[inviteb412111e]

Encore une petite question, quelqu'un a déjà utilisé un kit de purification des cDNA avant de faire une PCR-Q? Car j'ai fait une PCR-Q et il s'avère qu'il y a beaucoup de sels, ce qui fosse pas mal les résultats. Merci d'avance.

[piwi]

On utilise le kit qiagen quantitect et nous en sommes très content. On peut travailler avec de faibles quantités de materiel au départ (1µg d'ARN mais voir la suite), le rendement est plus que bon. Trop bon même étant donné que si le protocole invite à une dilution finale dans 20µl nous diluons toujours immédiatement dans 200µl et ensuite on ajuste!

[Annaick_R]

Bonjour,

quelqu'un a déjà utilisé un kit de purification des cDNA avant de faire une PCR-Q?

J'ai toujours fait mes PCR-Q directement sur les produits de RT sans purification des cDNA obtenus et ça marchait très bien.

Seule précaution, une étape d'élimination de l'ADN génomique (contaminant potentiel) par DNAse directement sur la colonne d'extraction des ARN totaux entre les 2 lavages avant l'élution. (je ne sais pas si je suis très claire). Ensuite RT, puis PCR-Q (SYBR-Green / GeneAmp System 9600 / Applied Biosystem).

Annaïck.

[inviteb412111e]

Ok Annaick, merci au fait u viens d'où dans le Finistère? Moi je suis du Finistère Nord, je travaille à Roscoff.

[Annaick_R]

Je suis dans le finistère Sud, à côté de Quimper.

C'est rigolo, j'ai fait mon stage de maîtrise à la station biologique de Roscoff (il y a un moment déjà). Si j'arrive à remettre la main sur mon mémoire, je regarderai le protocole d'extraction des ARN que j'avais utilisé... Mais je crois qu'il est chez mes parents.

je t'ai répondu aussi en message privé (pour ne pas polluer le fil de la discussion)

Annaïck.