Identification et caracterisation de protease

[invite81b669fe]

Bonjour a tous.

N'etant pas specialiste en biochimie, je me heurte a un probleme d'identification et de characterisation de protease. La problematique est la suivante :

Je sais que j'ai une ou plusieurs protease dans mes cellules qui clivent une proteine virale de fusion. Je sais que cette/ces protease est intracellulaire et apparement soluble.

Je pars vraiment de zero. J'aimerais identifier et characteriser cette protease en partant de rien, n'ayant que tres peu d'information.

Il me semble que la meilleure facon de debuter est de soumettre le lysat cellulaire a un panel de protease inhibitors (Sigma ou Roche) pour deja determiner la nature de la protease.

N'etant pas specialiste, jen appelle a votre savoir en biochimie. Quelles sont les voies classiques pour etudier et characteriser les proteases ? Y a t'il des chromatographies evidentes a faire dont je n'ai pas la connaissance ?

Merci pour votre temps et votre attention.
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[invite75e918c6]

Peut être une électrophorèse SDS-Page avec des marqueurs moléculaire? (pour connaitre le poids moléculaire)
le problème est tout de même isoler cette proétase de ton lysat cellulaire... (bon rien ne vaut une centrifugation )) )
Mais il y a aussi les chromatographies d'exclusion qui permet de purifier et de trier si on a un mélange.

Si tu as la protéase purifié, pourquoi pas faire une HPLC? (je ne sais pas si sa se fait sur des protéines ça...)

A moins que ce sont des chromatographies plus poussées dont moi non plus je ne connais...

[invite81b669fe]

Merci de ta reponse.
Le probleme pour tout ce qui est gel est que dans mon lysat j'ai certainement beaucoup de proteine donc je ne pourrai pas identifier ma protease dans tout ce melange.

L'idee peut etre serait de fractionner mon lysat et tester l'activite protease de chaque fraction, j'aurait peut etre ainsi une idee du poids moleculaire si je fractionne selon le poid moleculaire.

Mais bon ca s'arrete la, puisque ca me fait une belle jambe de connaitre le poids moleculaire uniquement

Il me faudrait une facon maline pour isoler cette protease.

Merci.

[invite75e918c6]

et si tu utilise une chromatographie d'affinité constitué d'anticorps spécifique à ta protéase? (je ne sais pas si ça existe)
Comme sa tu aura purifié ton lysat puis ensuite tu fais une identification classique ;-D

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite81b669fe]

et si tu utilise une chromatographie d'affinité constitué d'anticorps spécifique à ta protéase? (je ne sais pas si ça existe)
Comme sa tu aura purifié ton lysat puis ensuite tu fais une identification classique ;-D

Vu que je ne connais pas ma proteine, ca va etre difficile de trouver des anticorps contre celle ci.

[invite75e918c6]

hrmpf, pas évident de faire avec quand on n'a rien, je croyais que tu avais quand meme un peu sa spécificité ))

une centrifugation différencielle peut déjà un peu te séparer des éléments que tu ne souhaite pas et qui sont trop gros pour être ta protéase

Pour les anticorps, tu ne peux pas t'aider de sa capacité à cliver les protéines virale de fusion pour connaitre un peu comment est sa structure et trouvé un anticorps qui puisse être complémentaire à celui-ci? (tu pourrais ainsi vérifier par immunomarquage si cette protéine est bien celle que tu cherche par sa localisation intracellulaire ^^)

[invite81b669fe]

Ouais peut etre possible de trouver des anticorps contre ce type de protease...une fois que je saurais a quel type de protease j'ai a faire

Donc je vais commencer par faire une chromatographie pour determiner grossierement la taille et utiliser un panel d'inhibiteur de protease pour determiner sa categorie.

Merci pour ton aide.