Marquage par Ac-FITC : du solide ?

[invite240ac937]

Bonjour.

Je vais essayer de ne pas rentrer dans trop de détails pour ne pas noyer mes lecteurs .

Tout commence avec des cellules capables d'adhérer aux puits de ma plaque 96 puits.
Je tente de mettre au point un protocole pour doser une protéine produite dans certaines conditions (notamment en présence de substances toxiques).
Je pensais incuber les cellules dans les puits. Je peux éliminer le surnageant facilement.

Après la période d'incubation, j'aurais ajouté un anticorps anti-[protéine récherchée] ; puis un second anticorps marqué au FITC et dirigé contre l'anticorps du complexe précédent.

Pour schématiser grosso modo :
cible ----- Ac-anticible ----- Ac-anti-AC+FITC

Mon idée était ensuite de faire la lecture directement dans les puits avec un plate reader.

Problème : je dois éliminer l'excès d'anticorps marqués au FITC pour visualiser ceux étant reliés à la protéine cible.

La liaison Ac-Ag résiste-t-elle à l'aspiration d'une micropipette ?
-----

[Flyingbike]

bien sur ! idéalement il faudrait réaliser plusieurs lavages au PBS après l'anticorps primaire, et autant après le secondaire. Sinon tu auras énormément de bruit. La liaison Ac-Ag est costaude, tu peux rincer avec des litres sans décrocher quoi que ce soit.

Tu veux faire ça sur des cellules vivantes ou fixées ?

[invite240ac937]

Leur (sur)vie ne m'intéresse pas.
Il me faut seulement doser la quantité de protéine produite après 3 jours.

Je n'ai pas encore de protocole ; mais si elles doivent être tuées lors de l'une ou l'autre manipulation, je n'aurai pas d'état d'ame.
Je n'ai (pour l'instant) pas prévu de les fixer...


Cependant, un grosse limitation à cette expérience dont je viens de m'apercevoir est que le plate reader n'a que n'a pas les bonnes longueurs d'onde !
Je vais devoir faire autrement.

[inviteae6c05c4]

mais si elles doivent être tuées lors de l'une ou l'autre manipulation, je n'aurai pas d'état d'ame

Monstre !

Sinon, pour ton problème de longueur d'onde, il n'y a pas que le FITC ! (APC, PE... ?)

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

je ne pense pas que tu aies le choix. Quelle est la localisation cellulaire de ta protéine ? En immuno généralement on fixe les cellules puis on les perméabilise pour donner accès aux anticorps. Autre chose : ce type d'approche n'est que peu quantitatif !

[invite240ac937]

Monstre !

(Ne croyez pas que je me prends pour Dieu... J'ironisais la situation... )

Sinon, pour ton problème de longueur d'onde, il n'y a pas que le FITC !

Certes, mais nous disposons déjà de tout le matériel... J'essayais de "ressembler" au protocole qui tourne déjà ici.

Quelle est la localisation cellulaire de ta protéine ?

Il s'agit d'une protéine du cytosquelette.

ce type d'approche n'est que peu quantitatif !

Je ne cherche qu'à la doser semi-quantitativement.
Nous travaillons actuellement par point counting. Les cellules sont fixées sur lames puis révélées. Le comptage de la protéine révélée dépend d'un opérateur à l'autre, et j'ai bien peur que la qualité de l'image enregistrée par le microscope ne soit pas de qualité optimale...
D'où l'idée de retomber sur une valeur chiffrée (via spectromètre) qui me rassurerait plus...

[invite9eab997a]

Bonsoir,
Je dis peut etre une betise mais pourquoi pas un ELISA sur ton lysat? En plus, ca te permettrait de rapporter ton signal à la quantité de prot totale ce qui diminue la marge d'erreur.

[invite75e918c6]

Lors d'une assistance à une thèse sur le biofilm marqué au FITC, on ne faisait que 3 lavages consécutives après 2h d'incubation et 22h d'incubation, lavage au PBS, donc je ne vois pas le problème si tu souhaite éliminer l'excès d'anticorps par ce moyen (enfin on utilisais des lectines nous, pas des anticorps ^^)

[piwi]

Comme BioCell, j'aurais tendance à aller vers un test ELISA qui sera bien mieux accepté par des rapporteurs.

Cordialement,
piwi

[invite240ac937]

Entendu.

Je vais essayer de juger la faisabilité de la manip.

Merci à tous pour vos réponses.