Zymographie et nanoLC

[invite86fcfde5]

Bonjour à tous,

J'ai un petit soucis concernant la zymographie sur gel pour la détéction des métalloprotéases, je me suis renseigné sur internet, j'ai vu qu'il s'agissait d'une technique électrophorétique particulière qui consistait à copolymériser de la gélatine (substrat des gélatinases) avec de l'acrylamide. On colore le gel au bleu de Coomassie pour mettre en évidence les bandes correspondant aux MMPs.

Ce que je ne comprends pas vraiment c'est "Est ce que les bandes apparaissent claires sur fond bleu foncé?" Ce qui devrait signifier que les gélatinases ont dégradé la gélatine où elles ont migré et donc il n'y a pas de coloration à ces endroits?.
J'ai vu aussi qu'il fallait décolorer ensuite mais pourquoi?? Ca diminuerait le contraste non? Ou alors c'est pour que les gélatinases aussi colorées par le bleu de Coomassie ne le soient plus mais que la gélatine le soit encore? Ainsi apparation de bandes claires sur fond bleu?

J'ai du mal à tout comprendre comme vous le voyez..


Et je me posait aussi une autre question sur la nanoLC(chromatographie en phase liquide). On l'appelle nano parceque le diamètre de la colonne est inférieure aux chromatographies classiques? Si oui de quel ordre?

Un grand merci d'avance
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[invite5f6c2d79]

La gélatine et l'acrylamide vont former un gel avec un réseau particulier.
( en faisant varier le pourcentage d'acrylamide tu vas modifier le la taille des pores du réseau par exemple)

Ensuite sur ce gel tu vas déposer ton échantillon et tu vas le faire migrer selon les propriétés de ton échantillon.
( en 1D on fait migrer suivant la charge globale de la molécule
en 2D on fait migrer en plus de la 1D suivant le poids moléculaire )

Le bleue de coomassie sert à révéler l'endroit ou tes molécules ont migrées.
(Les bandes bleues foncés sont tes molécules et ce qui est plus claires est ton gel sans rien, sauf s'il y a eu une mauvaise migration et la tu auras plutôt des bandes bleues diffusent )

Ensuite les bandes bleues sont découpés du gel et c'est à ce moment la ou tu décolores tes bandes car par la suite tu vas extraire ce qu'il y a dans le gel et si on peut éviter d'avoir le bleue de coomassie lors de l'analyse de ta bande ca fera toujours une impureté en moins.
Sachant qu'a mon avis tu vas surement analyser tes molécules pas spectrométrie de masses, ca évitera d'avoir les pics de la coomassie dans ton spectre et tu pourras plus facilement utiliser les bases de données en lignes pour confirmer ce qu'il y avait dans ta bande.

Et la différence entre une LC et une nano-LC n'est pas la taille de la colonne mais plutôt les volumes d'injections.
Grosso-modo une LC c'est de l'ordre du mL ou µL alors qu'une nano c'est de l'ordre µL voir du nanoL.

[invite86fcfde5]

Merci pour votre réponse mais je n'ai pas tout saisie malheureusement :-/.

J'avais vu que les protéines étaient révélées par la présence de bandes claires sur gel foncé étant donné les protéines en question sont des enzymes qui vont dégrader la gélatine = MMP-9 et donc il n'y aura pas de coloration aux endroits de migration. Et on décolorer pour que les bandes apparaissent (ce que je n'avais pas compris).

Sinon pourquoi mettre de la gélatine dans le gel, il n'y aurait pas d'interêt si? Les gels d'électrophorèse classique n'en contiennent pas.
Help me SVP.

[invite5f6c2d79]

c'est bien de savoir que ton enzyme MMP-9
et c'est encore mieux de savoir ce qu'elle fait
ça aide à comprendre

http://www.anticorps-enligne.fr/anti...einase+9+MMP9/

La gélatine que tu mets dans le gel ce n'est pas la gélatine que tu manges !!!
Mais la gélatine qui appartient à la famille du collagène
http://fr.wikipedia.org/wiki/Collag%C3%A8ne

Pour résumer
tu mets une protéine dans ton gel
tu fais migrer une enzyme qui dégrade cette protéine
le bleue de coomassi colore le gel ou il y a cette protéine
les bandes claires sont les endroits ou il y a ton enzyme
tu les découpes
tu extrais l'enzyme des bandes
tu l'analyses

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite30157012]

Oui en fait tu avais bien compris dès le départ, je ne suis pas d'accord avec la 1ère explication de Bisacan. J'ai fait des zyogrammes de MMPs mais c'était il y a longtemps. En tous cas tu as effectivement des bandes transparentes là ou ton enzyme a migré et dégradé la gélatine sur un fond bleu, où la gélatine dans tout le reste du gel a été colorée. Parfois tu as plusieurs bandes qui correspondent aux différentes isoformes ou à la pro-MMP car il me semble que tu mets un tampon d'activation de l'enzyme. Quant à l'étape de décoloration, je crois qu'elle sert en effet à décolorer les endroits où tu as dégradé la gélatine, comme pour un coomassie classique, sinon tout le gel est bleu!

[invite86fcfde5]

Bonjour delphinette,

Un grand merci pour ta réponse, je suppose que tout le gel est bleu parce que le bleu de comassie colore les MMP aussi et en décolorant les zones ou les MMP ont migré vont être plus claires étant donné qu'il y a plus de gélatine a cet endroit la, de ce fait le gel se décolore plus rapidement. C'est bien ca?

merci d'avoir répondu à ma question

[invitee97a649d]

Bonsoir, j'ai un devoir à rendre et il y a deux questions à propos de la zymographie auxquelles je n'arrive pas à répondre. Est-ce que quelqu'un pourrait m'aider ?

1°) Un expérimentateur effectue une zymographie avec des lysats de différentes lignées cellulaires et n’obtient rien. Son témoin positif fonctionne (ce témoin provient d’un kit ELISA) et son marqueur de taille a bien migré aussi. Quelles sont vos hypothèses ? Que lui proposez-vous pour tester ce qui ne va pas ?


2°) Une expérimentatrice effectue une zymographie le lundi et tout fonctionne. Elle recommence le jour suivant avec les mêmes échantillons et les mêmes solutions mais n’obtient plus rien (surnageants de culture) même avec son témoin positif. Le marqueur de masse moléculaire a migré correctement. Quelles hypothèses peut-on faire ?

Je vous remercie d'avance

[Loulou66669]

Bonjour,
avez-vous eu des réponses j'ai un devoir similaire sur des problèmes de zymographie ?
Merci