Protéine et Absorbance

[invite87fd0031]

Bonjour à tous,

J'ai fait un tp en biochimie sur la spectrophotométrie.
Il s'agit de la Quantification d'une protéine par méthode directe ou indirecte.

Les premiers échantillons contiennent BSA et eau => lecture de l'absorbance à 280 nm

Les deuxièmes échantillons contiennet BSA, eau et réactif de Bradford => lecture de l'absorbance à 595 nm.

Je dois maitenant tracer un graphe sur excel de l'absorbance= f(quantité de protéine).

Mais le problème est que je ne sais pas du tout comment trouver la quantité de protéine à partir de l'absorbance et de quantité de BSA, eau et réactif de Bradford.

Est-ce que absorbance = quantité de protéine? Si oui, pourquoi et si non, que dois-je faire pour l'obtenir?

J'ai pas trouvé de réponses à ma question sur d'autres discussions, si j'ai mal regardé prière de m'excuser.

En vous remerciant d'avance pour les explications,

Sonic.
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[invite853321bf]

Il y a effectivement une relation entre absorbance et quantité de protéines. mais il y a un facteur. Que tu n'arrives pas à trouver la formule liant absorbance à quantité de x me parait bizarre. Tu dois mal faire tes recherches (pas un reproche, juste une constatation)
Pourquoi? Parce que certains groupements qui composent les acides aminés ont leur maximum d'absorption à 280nm.
Et le pic d'absorption du Bradford doit être à 595nm/

[invite87fd0031]

Oui les acides aminés aromatiques (tyrosine, tryptophane) sont responsables de l'absorbance des protéines à 280 nm. Donc la concentration totale en protéines d'une solution peut être musurée à 280 nm.

Mais malheureusement, je ne vois pas comment trouver cette concentration.

A moins qu'il faut que je fasse tout simplement:

Absorbance A = k x c x d

et en tirer le c mais ça me paraît simple mais je ne connais pas la constante k ni epsilon ( de epsilon = A / (c x d))

Est-ce la bonne méthode? Si non, j'aurai besoin d'un peu d'aide.

Merci

[Flyingbike]

tu dois certainement avoir une gamme étalon, non ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb4e69e1e]

La loi de Beer donne

A = E * l * c où A est l'absorbance, E le coefficient d'extinction de la protéine, l est la largeur de l'écahntillion et c la concentration de ta protéine.

Vu que tu travailles avec une seule protéine, E * l = une constante, du coup, tu as bien un lien entre l'absorbance et la concentration qui ne dépend que d'une constante... il faut juste trouver cette constante...

Astro

[Flyingbike]

c'est valable pour le dosage absolu sur protéine purifiée (280nm), mais pour le bradford il te faut quand même une gamme étalon.

[invite87fd0031]

Merci,
Mais je n'ai pas de gamme étalon, je crois. Je ne sais pas exactement ce que c'est donc si vous pouviez préciser ça m'arrangerait.

Est-ce que vous connaissez un moyen de trouer cette constante?

Les seules données que je possède sont le lambda max. et le epsilon max. pour certaines protéines et coenzymes.

Voici la liste: Liaison peptidique, pont disulfure, phénylananine, tyrosine, tryptophane, (je pense que ceux là sont important pour la résolution mais je sais pas comment les utiliser)

Sinon j'ai d'autres coenzymes comme la flavine, NADH, pyridoxal, hème II, Cis-rétinal, Chlorophylle A. Mais je doute que j'en ai l'utilité.

Merci encore pour votre aide.

Sonic

[invite87fd0031]

Voilà, je me suis rendu compte que je me creusais la tête depuis quelques heures déjà pour obtenir la quantité de protéine.

Il se trouve que depuis le début j'avais le BSA en microgramme/microlitres.

Mes excuses pour le dérangement.

Bonne journée

Sonic

[inviteb4e69e1e]

En effet, le BSA ou la gamma-globuline sont en général des standards utilisés pour des Bradford. On en connait la concentration et on peut donc calculer la fameuse constante, puis utiliser celle-ci pour estimer la concentration d'une autre protéine qui soit suffisamment semblable à ces standards(vu que le coefficient d'extinction dépend de la protéine).

Je crois que c'est quelque-chose comme ça, mais corrigez-moi si je me trompe...