D'une protéine à un gène à une protéine

[invitef5f4e5ca]

Bonjour,
Quelqu'un peut peut-être m'aider avec cette question un peu triviale : est-il possible de reproduire une protéine en ne disposant pas du gène qui la code?
En d'autres mots et via un exemple, est-il possible de "copier" un anticorps monoclonal si l'on ne dipose pas de cellules productrices (mais bien de la protéine/anticorps en question et en quantité suffisante)?
Je sais qu'il est aisé de déterminer la structure primaire d'un protéine (et donc d'un anticorps) et de procéder à une "reverse-translation" d'une telle séquence d'acide aminés en une hypothétique séquence nucléique. Mais cela peut-il être juste ainsi?
Je veux dire par là, est-ce qu'il suffit de tranférer ce matériel génétique dans une cellule productrice pour obtenir une production?
Cela peut-il être aussi "simple"?

Qu'en est-il des mécanismes post-transcriptionnels et post-translationnels? de la structure tertiaire et quaternaire? particulièrement pour les anticorps
Y a-t'il des exemples documentés d'un tel passage "protéine à gène à protéine"?

Merci d'avance pour tous vos commentaires.
Wil
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[Pfhoryan]

Bonjour,
Quelqu'un peut peut-être m'aider avec cette question un peu triviale : est-il possible de reproduire une protéine en ne disposant pas du gène qui la code?
En d'autres mots et via un exemple, est-il possible de "copier" un anticorps monoclonal si l'on ne dipose pas de cellules productrices (mais bien de la protéine/anticorps en question et en quantité suffisante)?
Je sais qu'il est aisé de déterminer la structure primaire d'un protéine (et donc d'un anticorps) et de procéder à une "reverse-translation" d'une telle séquence d'acide aminés en une hypothétique séquence nucléique. Mais cela peut-il être juste ainsi?
Je veux dire par là, est-ce qu'il suffit de tranférer ce matériel génétique dans une cellule productrice pour obtenir une production?
Cela peut-il être aussi "simple"?

Si tu connais la séquence primaire de ta protéine, tu peux acheter un gène synthétique pour environ 50 centimes la base.
Ensuite, si tu as besoin de modifications post-traductionnelles (glycosylation, formation de ponts disulfure) tu peux mettre ce gène dans un plasmide d'expression eucaryotique, et faire de l'expression dans des cellules CHO, par exemple.

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Pfhoryan
"Toute vérité franchit trois étapes. D’abord elle est ridiculisée. Ensuite, elle subit une forte opposition. Puis, elle est considérée comme ayant toujours été une évidence." - Arthur Schopenhauer

[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura,

La reverse transcription (production d'ADN à partir d'une matrice d'ARN) est bien connue. Mais la reverse translation n'a jamais été découverte. Votre raisonnement reposant sur ce phénomène jamais découvert, il est donc impossible au jour d'aujourd'hui.

En revanche, il est possible de synthétiser l'ADN correspondant à la protéine séquencée. Cela s'appelle la méthode des gènes synthétiques. Il suffit de prendre des amorces recouvrant toute la séquence voulue. Les amorces sens et anti-sens s'hybrident en partie sur toute la séquence d'intérêt, on met une Taq sans activité 5'-3' exonucléase qui va combler les espaces. On met ensuite une ligase qui va joindre les différents fragments entre eux : on a alors une séquence double brin d'ADN qui contient l'information génétique de la protéine voulue. Ensuite il faut insérer cette séquence dans un vecteur d'expression. Donc on aura pensé à ajouter des sites de restriction de part et d'autre du gène synthétique pour pouvoir l'insérer dans un vecteur. Ou alors on utilise une Taq sans activité 3'-5' exonucléase. Ainsi aux extrémités 3' on a un T sortant utilisable pour insérer le gène synthétique dans le vecteur (TA cloning).

Une fois dans le vecteur d'expression, le gène synthétique donne normalement la protéine d'intérêt.

Greg

Edit : je ne savais pas que des compagnies effectuaient la synthèse de gènes synthétiques.

[Pfhoryan]

Edit : je ne savais pas que des compagnies effectuaient la synthèse de gènes synthétiques.

Hé si.
Et ils optimisent les codons pour l'expression dans l'hôte choisi, ils optimisent les séquences pour la stabilité des mRNA, et on peut leur imposer des sites de restrictions dans le gène (pratique pour faire des cassettes)... Si on leur donne le plasmide d'expression, ils font même le clonage (mais il y a un surcoût de quelques centaines d'euros).
Ils commencent également à faire des mutations par synthèse pour environ 150-200 euros par mutation.

Au rythme où ça va, d'ici 4-5 ans, il ne sera probablement plus rentable de faire ses constructions/mutations soit-même, un peu comme ce qu'il s'est passé pour le séquençage d'ADN.

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Pfhoryan
"Toute vérité franchit trois étapes. D’abord elle est ridiculisée. Ensuite, elle subit une forte opposition. Puis, elle est considérée comme ayant toujours été une évidence." - Arthur Schopenhauer

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite17a570c1]

Edit : je ne savais pas que des compagnies effectuaient la synthèse de gènes synthétiques.

Sisi C'est quelque chose qui gagne en popularité. Par exemple, c'est une pratique assez courante dans le cadre d'iGEM (international Genetically Engineered Machine competition). Exemple : Geneart qui soutient la compète depuis 3 ans, si je ne m'abuse.

[invitef5f4e5ca]

Citation envoyée par LXR/Greg: ["... la reverse translation n'a jamais été découverte. Votre raisonnement reposant sur ce phénomène jamais découvert, il est donc impossible au jour d'aujourd'hui."]

Par la translation reverse, je sous-entendais la conversion d'une séquence d'acide aminés en séquence nucléotidique (suivant la relation acide aminé -> codon -> base).

Ce qui m'interpelle dans cette question, c'est cette possibilité de reproduire n'importe quel peptide ou protéine ... dès le moment où un décodage (aa -> nucléotide) a été établi.

Je suis bien conscient que de part la dégénérescence du code génétique (64 codons pour 20 acides aminés) de nombreuses séquences nucléotidiques peuvent ainsi être générées.

(1) Mais suffit-il de tester quelques insertions de telles séquences dans des cellules "productrices" pour espérer que l'une d'entre elles reproduise la protéine désirée?

(2) Si oui, auriez-vous des exemples concrets de telles manipulations?

(3) et quelle est la longueur maximale insérée repertoriée?

(4) N'y a-t'il pas des phénomènes d'épissage en jeu?

(5) Est-il seulement possible de protéger une protéine (tel qu'un anticorps monoclonal)? et à quel niveau d'après vous? au niveau peptidique ou génétique?

Mille mercis de vos commentaires.
Wil

[invite17a570c1]

Par la translation reverse, je sous-entendais la conversion d'une séquence d'acide aminés en séquence nucléotidique (suivant la relation acide aminé -> codon -> base).

Ce qui m'interpelle dans cette question, c'est cette possibilité de reproduire n'importe quel peptide ou protéine ... dès le moment où un décodage (aa -> nucléotide) a été établi.

Je suis bien conscient que de part la dégénérescence du code génétique (64 codons pour 20 acides aminés) de nombreuses séquences nucléotidiques peuvent ainsi être générées.

61 (les STOP ne définissant pas l'incorporation d'aa en général ).
Mais le truc est que tu sembles oublier plein de trucs :
* le code génétique différent de certaines bébêtes;
* plus grave encore : le biais d'usage du codon en général; les codons utilisés préférentiellement seront définis par plein de paramètres : %GC, biais lié à la position dans le génome (par exemple, chez les Métazoaires où tu as 2 sexes bien déterminés, tu as un biais lié au sexe; de plus, les gènes dont l'expression est plus élevés chez les mâles ont tendance à "fuir" le chromosome X);
* j'en oublie certainement (ou j'ai trop hâte de sortir me promener, au choix )

(1) Mais suffit-il de tester quelques insertions de telles séquences dans des cellules "productrices" pour espérer que l'une d'entre elles reproduise la protéine désirée?

Courage pour n'en tester qu'une déjà Ce n'est pas quelque chose que tu fais "juste en passant".

Sinon, tu as un exemple d'autre chose de fait : la synthèse complète d'un génome entier. Craig Venter l'a fait par exemple et a remplacé le génome d'une bactos par ce génome synthétique. Tu as d'autres exemples aussi qui parlent de synthèse de matériel génétique viral pour en vérifier le degré d'infectibilité, etc.