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Pcr



  1. #1
    Cons2

    Pcr

    Bonjour,
    j'ai un tp sur la PCR et je dois proposer un protocole d'amplification (nom, température et durée des étapes)?
    Moi j'ai mis : dénaturation de l'adn(10 à 15 min à 95°),puis hybridation (40 à 65°) et élongation (à 72°)
    Pouvez-vous me dire si c'est bien cela?
    Merci

    -----


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  3. #2
    LXR

    Re : Pcr

    Ton protocole n'est pas bon, dénaturation trop longue et gamme de température d'hybridation trop vague. Généraliser est difficile car les protocoles de PCR dépendent de ce qu'on veut amplifier, de l'enzyme utilisée pour la polymérisation, et du Tm des primers. Par exemple, un protocole pour amplifier des fragments de plasmides de 1 kpb, avec la Taq DNA Polymérase et primers avec Tm autour de 59-61 °C :

    - Dénaturation : 95°C ; 1 min
    - Hybridation : 60 °C ; 1 min
    - Polymérisation : 72°C ; 1 min
    ->Répétition 25 fois

    C'est le protocole de PCR le plus simple que je connaisse. Selon les primers utilisés, l'hybridation peut varier de 55 à 60°C.

    Greg
    Dernière modification par LXR ; 01/03/2009 à 12h18.
    Never give up.

  4. #3
    Katie20012

    Re : Pcr

    Oui c'est exactement ça
    "On se lasse de tout,excepté d'apprendre."-Virgile.

  5. #4
    Moumoutte

    Re : Pcr

    Citation Envoyé par LXR Voir le message
    Ton protocole n'est pas bon, dénaturation trop longue.
    Peut être que Cons2 faisait référence à l'étape de dénaturation avant de commencer les cycles où on chauffe l'échantillon à 90-95°C pendant un certain temps pour s'assurer que tous les brins sont bien dénaturés. Cela dit, 5 min suffisent.

    On peut parfois, mais tout le monde ne le fait pas, rajouter une étape à 70-72°C lorsque tous les cycles sont terminés pour permettre à l'enzyme de bien finir la polymérisation sur tous les brins.

    Cordialement

  6. #5
    Cons2

    Re : Pcr

    merci pour votre aide

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    milouze13

    Re : Pcr

    bonjour,

    moi j'ai un autre soucis je voudrais denaturer un fragment d'ADN mais de facon stable. J'ai essaye de chauffer mon ADN a 95 degres pendant 10 min et de le plonger dans la glace immediatement apres mais ca ne fonctionne pas...Avez vous une solution? merci d'avance.

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  10. #7
    piwi

    Re : Pcr

    Plutôt que 1 minute, 30 secondes suffisent. M'enfin là c'est du bricolage.

    Pour dénaturer définitivement l'ADN je ne vois pas de solution miracle là immédiatement. Si ça me revient, je vous fais signe.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  11. #8
    laylouchka

    Re : Pcr

    bonjour moi je cherche à fabriquer des primers d'IL-10humain avec des sites de réstrictions Bamh1 au début et Sal 1 à la fin
    pour cela j'ai cherché sur le net le cDNA de l'IL10 mais le problème c que je ne trouve pas de séquance ACC AUG G qui est un contexte optimal
    on m'a conseillé de prendre la séquance nucléotidique du cDNA et de la traduire en Acide Aminé chose que j'ai faite et j'ai obtenu 3 Framds le sens 5`3` et 3 autres ds 3`5` selon les dif cadre de lécture
    Alors ma question est : je ne comprends pas pourquoi ds toutes les Fram il ya plusieurs codon STOP (plus de 6 ) car j'ai toujs pensé qu'une proteine commence par une MET ( bien qu'il puisse y avoir d'autre MET à l'interieurs bien sure ) et fini par un codon STOP
    en plus je ne comprends pas prq on a des FRAM 3`5`la traduction ne se fait elle pas que ds un sens ?
    svp aidez moi !!!
    merci

  12. #9
    piwi

    Re : Pcr

    Je ne sais pas trop où vous êtes aller chercher votre transcrit. Peu importe le voici:
    Citation Envoyé par transcrit hIL-10
    ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTG GTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCA G
    GCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCA CCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGC
    TTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAG TGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGC
    TGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGC TGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCC
    AAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACC TGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACC
    AAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACT CCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGC
    TGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTC CCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGC
    AGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAG AGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGT
    TTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCT ACATGACAATGAAGATACGAAACTGA
    Il n'est absolument pas truffé de codons stop:
    Citation Envoyé par protéine hIL-10
    MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSC THFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQ
    LDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFY LEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLR
    LRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQ EKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSTOP
    Cordialement,
    piwi
    Dernière modification par piwi ; 03/03/2009 à 15h10.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  13. #10
    laylouchka

    Re : Pcr

    bonjour
    merci pour votre envois mais pouriez vous me dire si c bien de l'IL10 humainet ou vous avez trouvez cette séquance car moi g trouvé sur ce lien http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/v...rand=2&dopt=gb une toute autre séquance et qui est bcp plus longue
    1 acacatcagg ggcttgctct tgcaaaacca aaccacaaga cagacttgca aaagaaggca
    61 tgcacagctc agcactgctc tgttgcctgg tcctcctgac tggggtgagg gccagcccag
    121 gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg cctaacatgc
    181 ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttgtgagt atgattcctt
    241 cctgtccttt ctctcttcct gggactgcct gaactagaca ttctcctgga actataagaa
    301 ccctcctcct gcgcctccac ctccatcccc aacacctatt cccccaaact taaattctta
    361 agagaatcct agatcaagcc atgggtttgg tgagttaagc taagccagat gatacagtaa
    421 atgtgcagga aacctgcctt ataaagtaaa tgcgttctct ctcgtgctga gaaacttata
    481 agatcctgct ggcgctctat actttattgg ctaggagaag taaagaaatg tctgattcga
    541 ggtgaagatg ctccccatgc cttgcagcag ggaaatttaa attgcctctg cttagagcgt
    601 ttccagacct gaaagaccag tggtttaggg aagcactcta catgagggaa acctgcatta
    661 gaaggagctt cttaatccct gggatctttc caagctaaac tggatgtcta cagtggggag
    721 aaagaaaagc agagaacagg acatgagggg ggctcaaggc cccgaagggt tgacataggt
    781 gtcccttaaa gccgaatgta gctccgcaga aagaagacca ggactgagtc aagcttctgc
    841 tttcccttca aaatcggcca gattttttaa ataacttgac tctgaggagg aggacctgat
    901 ttaagtgatg gtcccatcac tgttgaatcc tctgttttta aaactcccct tttgattttt
    961 ttgggccaga gccaatttta tttaaaaaaa aaaatctcta aatgaaaggg catcaaaaag
    1021 accgcatttc agttatttcc ccaaacctca agttcattct ccttttgttc ttcctgcagc
    1081 aaatgaagga tcagctggac aacttgttgt taaaggagtc cttgctggag gactttaagg
    1141 tgagagcagg ggcggggtgc tgggggagtg tgcagcatga ttaagggaag ggagactctg
    1201 cttcctgatt gcagggaatt gggtttgttt ccttcgcttt gaaaaggaga agtgggaaga
    1261 tgttaactca gcacatccag cagccagagg gtttacaaag ggctcagtcc cttcggggag
    1321 gcttctggtg aaggaggatc gctagaacca agctgtcctc ttaagctagt tgcagcagcc
    1381 cctcctccca gccacctccg ccaatctctc actcaccttt ggctcctgcc cttagggtta
    1441 cctgggttgc caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca
    1501 agctgagaac caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa
    1561 gaccctcagg ctgaggctac ggcgctgtgt aagtagcaga tcagtttttt cccttgcagc
    1621 tgcccccaaa ataccatctc ctacagacca gcagggacac tcacatccac agacacagca
    1681 aagacacaga ctggcagagc tagctgtaaa tgaggaaaga ctcctggagt cagatctctt
    1741 gctcatttct ctttgagcag gcgttggggg tggctgctag gcatttacat gtgaaatttg
    1801 caaacagctt tcctgttatt tgtgagtcat ttgtgggtta ttaactactc ccctctctct
    1861 tcataaaagg agcccagagc ttcagtcagg cctccactgc ctctttgtaa ctagaccctg
    1921 ggcggggagc taaggttccc aagcagagga aacatcattc acctctttta atctcaatgt
    1981 tttgaaagca aagctctaag aagggcccaa ttgactgaca ggatttcccc tggcatttta
    2041 gaagggacaa gggggctatt catccccagg ctagtgtcta tgagtaattc ctccaggtaa
    2101 tttatttctc caactgaaat gatgccctca ctactaatgg tttcccctgt tctgtcacca
    2161 atattggaaa atcagttggt gtctatttgt aggacaaggc tatgtgaagg gtttggtccc
    2221 agtagcttcc ctcctcagat gcttagaagt gttcctcggt ggctgtgact gacggggagg
    2281 aacaggagag agaggcagaa aaggacaggc tgaagaatgc ctcgctcagc actgcaggag
    2341 atactgtaga gttctggggg aggaaggaat cccaagacct gggttgtcat ccaagccttg
    2401 caaacatctt ggagtgagtc ctggagaaat acatttaact cccagggcca tggaagcagg
    2461 gctcagttct ctctgggagc tgtgaggcaa ggcatttgga taaatctggc ctcctcatga
    2521 tgccaccagc ttgtccccta agtgtgatgg acatggagct ggaagccagg atcaccaaca
    2581 ctttctcttt tcttccacag catcgatttc ttccctgtga aaacaagagc aaggccgtgg
    2641 agcaggtgaa gaatgccttt aataaggtga gcttggatgg tggcagagag ggtctgcaga
    2701 gcacaaccca tgcccactcc ccaaccccaa agcatggaag gtggtgggga ctcaataggc
    2761 cccattcttc attggagaga gtgtgggaac ctgacagatg gtatgacctg ctcagccagt
    2821 gaggagctgc tgccttgatt gtatttgttt tctgttaagt gtctttgggg gtttctaaat
    2881 gactgctcgc tgcctttgca ggcttgcggg ttaggctggc cggccagcct gtgaacacag
    2941 tgagctgcat gctggggaga gtgacaaagg aaacagaaag tacagaaagt agcttgttgg
    3001 gaatctaggc tgaacccaca cgtgcaggaa gctggcacat aaatgtgcac atacaaatac
    3061 acctgggggt tcagcccaga ctccccagaa ctcagaatga gcaggaagct ggattctcac
    3121 ttaacctgga gttggttcaa gcccgctttc catctgccct tcgcacctgc ggaggtgcct
    3181 gagaatgtca gttcccaaac gaaatggggt ttcacacttc caactgtgcg tgaacttttt
    3241 cagtctgatt tcccagaaac cgtgcggcct atgtcctcct cgtgggctgg ggacagacac
    3301 tgcacagagt gccaacatca gggggtgtga atttctcata gtaggtcagg gcggcagggc
    3361 agggcctgct cagtgtgttg gtgggagaac acagacattt aaaaggctcc ctcctctcct
    3421 ctcaccgtct tgctttcgaa gcgcttcctc taatgtcttt tcatcaaact ctgcataatc
    3481 atcatgtgaa tacgtgacct ttaaaattgt tgaaaaggca tcattttgaa gacagtgctt
    3541 tgcaaaatga atgctcccct tgctaggggg aggcctggag gagatgaagg tcaatgcaca
    3601 gcctttccca aggcagctag gcctatcctc tggtttactt cccagcgtga gggagaacaa
    3661 gcaacctctg cactcaaggt catgcccatc catgagcatg agggagggga gcctatttag
    3721 tccccagaaa ggattttaac tgtatgtttc ttatctctct gcacagctcc aagagaaagg
    3781 catctacaaa gccatgagtg agtttgacat cttcatcaac tacatagaag cctacatgac
    3841 aatgaagata cgaaactgag acatcagggt ggcgactcta tagactctag gacataaatt
    3901 agaggtctcc aaaatcggat ctggggctct gggatagctg acccagcccc ttgagaaacc
    3961 ttattgtacc tctcttatag aatatttatt acctctgata cctcaacccc catttctatt
    4021 tatttactga gcttctctgt gaacgattta gaaagaagcc caatattata atttttttca
    4081 atatttatta ttttcacctg tttttaagct gtttccatag ggtgacacac tatggtattt
    4141 gagtgtttta agataaatta taagttacat aagggaggaa aaaaaatgtt ctttggggag
    4201 ccaacagaag cttccattcc aagcctgacc acgctttcta gctgttgagc tgttttccct
    4261 gacctccctc taatttatct tgtctctggg cttggggctt cctaactgct acaaatactc
    4321 ttaggaagag aaaccaggga gcccctttga tgattaattc accttccagt gtctcggagg
    4381 gattccccta acctcattcc ccaaccactt cattcttgaa agctgtggcc agcttgttat
    4441 ttataacaac ctaaatttgg ttctaggccg ggcgcggtgg ctcacgcctg taatcccagc
    4501 actttgggag gctgaggcgg gtggatcact tgaggtcagg agttcctaac cagcctggtc
    4561 aacatggtga aaccccgtct ctactaaaaa tacaaaaatt agccgggcat ggtggcgcgc
    4621 acctgtaatc ccagctactt gggaggctga ggcaagagaa ttgcttgaac ccaggagatg
    4681 gaagttgcag tgagctgata tcatgcccct gtactccagc ctgggtgaca gagcaagact
    4741 ctgtctcaaa aaataaaaat aaaaataaat ttggttctaa tagaactcag ttttaactag
    4801 aatttattca attcctctgg gaatgttaca ttgtttgtct gtcttcatag cagattttaa
    4861 ttttgaataa ataaatgtat cttattcaca tc

  14. #11
    piwi

    Re : Pcr

    Je crois que ce que vous avez c'est le gène. Un morceau de chromosome quoi.
    Moi ce que je vous ai donné c'est le cDNA. Pour le trouver c'est assez simple quand on sait faire. Allez sur ensembl.org et sélectionnez la rubrique human puis tapez il-10 dans la barre de recherche.
    La page va vous renvoyer une liste de demandes correspondantes; la bonne est bien évidemment la première.
    Ensuite en haut de la page qui va s'afficher on vous dira qu'il existe un transcrit pour le gene (ENST00000367099). Cliquez dessus puis encore dans une nouvelle page vous trouverez dans la colonne de gauche un lien vers "exons (5)". Ce qui apparaitra en violet correspond aux régions non traduites. Sélectionnez simplement les région traduites (en noir) et vous avez votre ORF.

    Ca parait compliqué comme cela mais quand on sait se servir du site, trouver ce que vous demandiez ne m'a pas pris plus que 20 secondes.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  15. #12
    laylouchka

    Re : Pcr

    merci encore une fois
    j'ai exactement ce que vous m'avez dis et il ya une dif de 2nucléotides ( le votre contien 537nts et le mien 535 nts ) mais je n'arrive pas à trouver l'éreur ceci est important pour la traduction en a.a
    et je voudrais aussi savoir comment avez vous trouvé la bonne séquance d'aa conréspondante
    merci

  16. Publicité
  17. #13
    piwi

    Re : Pcr

    Je repris la méthode point par point et je trouve toujours 537. Je ne sais pas pourquoi il vous manque deux nucléotides.

    Pour trouver la séquence peptidique j'utilise le programme ExPASy

    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  18. #14
    laylouchka

    Re : Pcr

    je ne sais pas comment vous remercier j'avait tous ces outils mais ça ne m'a pas suffit pour trouver les bonnes réponses vous m'avez vraiment bcp aidé merci infiniment

  19. #15
    laylouchka

    Exclamation Re : Pcr

    bonjour !
    je voudrai faire une PCR pour chercher la présance de cellules allogénique de souris C57 dans differants organes de souris receveuse Balb /c pour cela j'ai besoin d'acheter des primer du gene H2-b pour cette PCR or je ne c'est pas vers quel fournisseur je peux m'adresser , invitrogen me dit que c'est à moi de construire la séquance génétique des primer mais g peur de faire n'importe quoi pouvez vous m'aider
    merci

  20. #16
    LXR

    Re : Pcr

    Pas de conseil de fournisseur sur le forum sinon le message le faisant sera immédiatement supprimé.

    Pour la modération,

    Greg

  21. #17
    laylouchka

    Re : Pcr

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Je crois que ce que vous avez c'est le gène. Un morceau de chromosome quoi.
    Moi ce que je vous ai donné c'est le cDNA. Pour le trouver c'est assez simple quand on sait faire. Allez sur ensembl.org et sélectionnez la rubrique human puis tapez il-10 dans la barre de recherche.
    La page va vous renvoyer une liste de demandes correspondantes; la bonne est bien évidemment la première.
    Ensuite en haut de la page qui va s'afficher on vous dira qu'il existe un transcrit pour le gene (ENST00000367099). Cliquez dessus puis encore dans une nouvelle page vous trouverez dans la colonne de gauche un lien vers "exons (5)". Ce qui apparaitra en violet correspond aux régions non traduites. Sélectionnez simplement les région traduites (en noir) et vous avez votre ORF.

    Ca parait compliqué comme cela mais quand on sait se servir du site, trouver ce que vous demandiez ne m'a pas pris plus que 20 secondes.

    Cordialement,
    piwi
    bonjour j'aurais besoin de vos lumiéres
    je cherche à fabriquer des primer du gene H2-b de la souri C57BL/6 j'ai essayé de faire ce que vous m'avez indiqué lors d'une enciénne conversation mais je n'y comprends rien! pouvez vous m'aider ?!
    merci d'avance

  22. #18
    laylouchka

    Re : Pcr

    bonjour j'aurais besoin de vos lumiéres
    je cherche à fabriquer des primer du gene H2-b de la souri C57BL/6 j'ai essayé de faire ce que vous m'avez indiqué lors d'une enciénne conversation mais je n'y comprends rien! pouvez vous m'aider ?!
    merci d'avance

  23. Publicité
  24. #19
    piwi

    Re : Pcr

    Vous n'avez toujours pas réussi à écrire deux oligos?

    Suivez pas à pas la démarche que j'avais indiqué (elle est toujours valable, il m'a fallu un court instant pour trouver la séquence de l'histone H2B).
    Une fois que vous l'avez, passez la dans primerblast (NCBI). Il va vous sortir des paires (sans doute pas beaucoup) d'oligo spécifiques.
    Je vous conseille toutefois de les blaster vous même ensuite (Nblast). Les histones sont pas mal conservés et il doit être difficile de trouver l'oligo archi spécifique.
    Si ça n'existe pas (c'est possible). Repérez une région spécifique de H2B, un ou deux nucléotides feront l'affaire et écrivez votre oligo de sorte qu'il se termine en 3' sur cette région. Un seul devrait suffir pour que la PCR soit spécifique. Le hic c'est qu'il vous faut vérifier la spécificité de la région sur tous les histones (le cas échéant pensez aux variants d'histones, et malheureusement il y en a un paquet).

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  25. #20
    laylouchka

    Re : Pcr

    bonjour
    je crain qu'il n'ai eu conffusion je ne cherche pas à amplifier l'histone H2B mais je cherche à amplifier le gene H-2b de la souris C57BL/6 ( qui est l'équivalent du systeme HLA chez l'homme ) et j'ai fais exactement ce que vous m'avez dit mais ça ne marche pas du tout ! pouvez vous essayer de votre côté
    merci d'avance !

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