Bonjour,
j'ai un tp sur la PCR et je dois proposer un protocole d'amplification (nom, température et durée des étapes)?
Moi j'ai mis : dénaturation de l'adn(10 à 15 min à 95°),puis hybridation (40 à 65°) et élongation (à 72°)
Pouvez-vous me dire si c'est bien cela?
Merci
Ton protocole n'est pas bon, dénaturation trop longue et gamme de température d'hybridation trop vague. Généraliser est difficile car les protocoles de PCR dépendent de ce qu'on veut amplifier, de l'enzyme utilisée pour la polymérisation, et du Tm des primers. Par exemple, un protocole pour amplifier des fragments de plasmides de 1 kpb, avec la Taq DNA Polymérase et primers avec Tm autour de 59-61 °C :
- Dénaturation : 95°C ; 1 min
- Hybridation : 60 °C ; 1 min
- Polymérisation : 72°C ; 1 min
->Répétition 25 fois
C'est le protocole de PCR le plus simple que je connaisse. Selon les primers utilisés, l'hybridation peut varier de 55 à 60°C.
Greg
Oui c'est exactement ça
Peut être que Cons2 faisait référence à l'étape de dénaturation avant de commencer les cycles où on chauffe l'échantillon à 90-95°C pendant un certain temps pour s'assurer que tous les brins sont bien dénaturés. Cela dit, 5 min suffisent.Envoyé par LXR
On peut parfois, mais tout le monde ne le fait pas, rajouter une étape à 70-72°C lorsque tous les cycles sont terminés pour permettre à l'enzyme de bien finir la polymérisation sur tous les brins.
Cordialement
merci pour votre aide
bonjour,
moi j'ai un autre soucis je voudrais denaturer un fragment d'ADN mais de facon stable. J'ai essaye de chauffer mon ADN a 95 degres pendant 10 min et de le plonger dans la glace immediatement apres mais ca ne fonctionne pas...Avez vous une solution? merci d'avance.
Plutôt que 1 minute, 30 secondes suffisent. M'enfin là c'est du bricolage.
Pour dénaturer définitivement l'ADN je ne vois pas de solution miracle là immédiatement. Si ça me revient, je vous fais signe.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
bonjour moi je cherche à fabriquer des primers d'IL-10humain avec des sites de réstrictions Bamh1 au début et Sal 1 à la fin
pour cela j'ai cherché sur le net le cDNA de l'IL10 mais le problème c que je ne trouve pas de séquance ACC AUG G qui est un contexte optimal
on m'a conseillé de prendre la séquance nucléotidique du cDNA et de la traduire en Acide Aminé chose que j'ai faite et j'ai obtenu 3 Framds le sens 5`3` et 3 autres ds 3`5` selon les dif cadre de lécture
Alors ma question est : je ne comprends pas pourquoi ds toutes les Fram il ya plusieurs codon STOP (plus de 6 ) car j'ai toujs pensé qu'une proteine commence par une MET ( bien qu'il puisse y avoir d'autre MET à l'interieurs bien sure ) et fini par un codon STOP
en plus je ne comprends pas prq on a des FRAM 3`5`la traduction ne se fait elle pas que ds un sens ?
svp aidez moi !!!
merci
Je ne sais pas trop où vous êtes aller chercher votre transcrit. Peu importe le voici:
Il n'est absolument pas truffé de codons stop:
Cordialement,
piwi
Dernière modification par piwi ; 03/03/2009 à 16h10.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
bonjour
merci pour votre envois mais pouriez vous me dire si c bien de l'IL10 humainet ou vous avez trouvez cette séquance car moi g trouvé sur ce lien http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/v...rand=2&dopt=gb une toute autre séquance et qui est bcp plus longue
1 acacatcagg ggcttgctct tgcaaaacca aaccacaaga cagacttgca aaagaaggca
61 tgcacagctc agcactgctc tgttgcctgg tcctcctgac tggggtgagg gccagcccag
121 gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg cctaacatgc
181 ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttgtgagt atgattcctt
241 cctgtccttt ctctcttcct gggactgcct gaactagaca ttctcctgga actataagaa
301 ccctcctcct gcgcctccac ctccatcccc aacacctatt cccccaaact taaattctta
361 agagaatcct agatcaagcc atgggtttgg tgagttaagc taagccagat gatacagtaa
421 atgtgcagga aacctgcctt ataaagtaaa tgcgttctct ctcgtgctga gaaacttata
481 agatcctgct ggcgctctat actttattgg ctaggagaag taaagaaatg tctgattcga
541 ggtgaagatg ctccccatgc cttgcagcag ggaaatttaa attgcctctg cttagagcgt
601 ttccagacct gaaagaccag tggtttaggg aagcactcta catgagggaa acctgcatta
661 gaaggagctt cttaatccct gggatctttc caagctaaac tggatgtcta cagtggggag
721 aaagaaaagc agagaacagg acatgagggg ggctcaaggc cccgaagggt tgacataggt
781 gtcccttaaa gccgaatgta gctccgcaga aagaagacca ggactgagtc aagcttctgc
841 tttcccttca aaatcggcca gattttttaa ataacttgac tctgaggagg aggacctgat
901 ttaagtgatg gtcccatcac tgttgaatcc tctgttttta aaactcccct tttgattttt
961 ttgggccaga gccaatttta tttaaaaaaa aaaatctcta aatgaaaggg catcaaaaag
1021 accgcatttc agttatttcc ccaaacctca agttcattct ccttttgttc ttcctgcagc
1081 aaatgaagga tcagctggac aacttgttgt taaaggagtc cttgctggag gactttaagg
1141 tgagagcagg ggcggggtgc tgggggagtg tgcagcatga ttaagggaag ggagactctg
1201 cttcctgatt gcagggaatt gggtttgttt ccttcgcttt gaaaaggaga agtgggaaga
1261 tgttaactca gcacatccag cagccagagg gtttacaaag ggctcagtcc cttcggggag
1321 gcttctggtg aaggaggatc gctagaacca agctgtcctc ttaagctagt tgcagcagcc
1381 cctcctccca gccacctccg ccaatctctc actcaccttt ggctcctgcc cttagggtta
1441 cctgggttgc caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca
1501 agctgagaac caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa
1561 gaccctcagg ctgaggctac ggcgctgtgt aagtagcaga tcagtttttt cccttgcagc
1621 tgcccccaaa ataccatctc ctacagacca gcagggacac tcacatccac agacacagca
1681 aagacacaga ctggcagagc tagctgtaaa tgaggaaaga ctcctggagt cagatctctt
1741 gctcatttct ctttgagcag gcgttggggg tggctgctag gcatttacat gtgaaatttg
1801 caaacagctt tcctgttatt tgtgagtcat ttgtgggtta ttaactactc ccctctctct
1861 tcataaaagg agcccagagc ttcagtcagg cctccactgc ctctttgtaa ctagaccctg
1921 ggcggggagc taaggttccc aagcagagga aacatcattc acctctttta atctcaatgt
1981 tttgaaagca aagctctaag aagggcccaa ttgactgaca ggatttcccc tggcatttta
2041 gaagggacaa gggggctatt catccccagg ctagtgtcta tgagtaattc ctccaggtaa
2101 tttatttctc caactgaaat gatgccctca ctactaatgg tttcccctgt tctgtcacca
2161 atattggaaa atcagttggt gtctatttgt aggacaaggc tatgtgaagg gtttggtccc
2221 agtagcttcc ctcctcagat gcttagaagt gttcctcggt ggctgtgact gacggggagg
2281 aacaggagag agaggcagaa aaggacaggc tgaagaatgc ctcgctcagc actgcaggag
2341 atactgtaga gttctggggg aggaaggaat cccaagacct gggttgtcat ccaagccttg
2401 caaacatctt ggagtgagtc ctggagaaat acatttaact cccagggcca tggaagcagg
2461 gctcagttct ctctgggagc tgtgaggcaa ggcatttgga taaatctggc ctcctcatga
2521 tgccaccagc ttgtccccta agtgtgatgg acatggagct ggaagccagg atcaccaaca
2581 ctttctcttt tcttccacag catcgatttc ttccctgtga aaacaagagc aaggccgtgg
2641 agcaggtgaa gaatgccttt aataaggtga gcttggatgg tggcagagag ggtctgcaga
2701 gcacaaccca tgcccactcc ccaaccccaa agcatggaag gtggtgggga ctcaataggc
2761 cccattcttc attggagaga gtgtgggaac ctgacagatg gtatgacctg ctcagccagt
2821 gaggagctgc tgccttgatt gtatttgttt tctgttaagt gtctttgggg gtttctaaat
2881 gactgctcgc tgcctttgca ggcttgcggg ttaggctggc cggccagcct gtgaacacag
2941 tgagctgcat gctggggaga gtgacaaagg aaacagaaag tacagaaagt agcttgttgg
3001 gaatctaggc tgaacccaca cgtgcaggaa gctggcacat aaatgtgcac atacaaatac
3061 acctgggggt tcagcccaga ctccccagaa ctcagaatga gcaggaagct ggattctcac
3121 ttaacctgga gttggttcaa gcccgctttc catctgccct tcgcacctgc ggaggtgcct
3181 gagaatgtca gttcccaaac gaaatggggt ttcacacttc caactgtgcg tgaacttttt
3241 cagtctgatt tcccagaaac cgtgcggcct atgtcctcct cgtgggctgg ggacagacac
3301 tgcacagagt gccaacatca gggggtgtga atttctcata gtaggtcagg gcggcagggc
3361 agggcctgct cagtgtgttg gtgggagaac acagacattt aaaaggctcc ctcctctcct
3421 ctcaccgtct tgctttcgaa gcgcttcctc taatgtcttt tcatcaaact ctgcataatc
3481 atcatgtgaa tacgtgacct ttaaaattgt tgaaaaggca tcattttgaa gacagtgctt
3541 tgcaaaatga atgctcccct tgctaggggg aggcctggag gagatgaagg tcaatgcaca
3601 gcctttccca aggcagctag gcctatcctc tggtttactt cccagcgtga gggagaacaa
3661 gcaacctctg cactcaaggt catgcccatc catgagcatg agggagggga gcctatttag
3721 tccccagaaa ggattttaac tgtatgtttc ttatctctct gcacagctcc aagagaaagg
3781 catctacaaa gccatgagtg agtttgacat cttcatcaac tacatagaag cctacatgac
3841 aatgaagata cgaaactgag acatcagggt ggcgactcta tagactctag gacataaatt
3901 agaggtctcc aaaatcggat ctggggctct gggatagctg acccagcccc ttgagaaacc
3961 ttattgtacc tctcttatag aatatttatt acctctgata cctcaacccc catttctatt
4021 tatttactga gcttctctgt gaacgattta gaaagaagcc caatattata atttttttca
4081 atatttatta ttttcacctg tttttaagct gtttccatag ggtgacacac tatggtattt
4141 gagtgtttta agataaatta taagttacat aagggaggaa aaaaaatgtt ctttggggag
4201 ccaacagaag cttccattcc aagcctgacc acgctttcta gctgttgagc tgttttccct
4261 gacctccctc taatttatct tgtctctggg cttggggctt cctaactgct acaaatactc
4321 ttaggaagag aaaccaggga gcccctttga tgattaattc accttccagt gtctcggagg
4381 gattccccta acctcattcc ccaaccactt cattcttgaa agctgtggcc agcttgttat
4441 ttataacaac ctaaatttgg ttctaggccg ggcgcggtgg ctcacgcctg taatcccagc
4501 actttgggag gctgaggcgg gtggatcact tgaggtcagg agttcctaac cagcctggtc
4561 aacatggtga aaccccgtct ctactaaaaa tacaaaaatt agccgggcat ggtggcgcgc
4621 acctgtaatc ccagctactt gggaggctga ggcaagagaa ttgcttgaac ccaggagatg
4681 gaagttgcag tgagctgata tcatgcccct gtactccagc ctgggtgaca gagcaagact
4741 ctgtctcaaa aaataaaaat aaaaataaat ttggttctaa tagaactcag ttttaactag
4801 aatttattca attcctctgg gaatgttaca ttgtttgtct gtcttcatag cagattttaa
4861 ttttgaataa ataaatgtat cttattcaca tc
Je crois que ce que vous avez c'est le gène. Un morceau de chromosome quoi.
Moi ce que je vous ai donné c'est le cDNA. Pour le trouver c'est assez simple quand on sait faire. Allez sur ensembl.org et sélectionnez la rubrique human puis tapez il-10 dans la barre de recherche.
La page va vous renvoyer une liste de demandes correspondantes; la bonne est bien évidemment la première.
Ensuite en haut de la page qui va s'afficher on vous dira qu'il existe un transcrit pour le gene (ENST00000367099). Cliquez dessus puis encore dans une nouvelle page vous trouverez dans la colonne de gauche un lien vers "exons (5)". Ce qui apparaitra en violet correspond aux régions non traduites. Sélectionnez simplement les région traduites (en noir) et vous avez votre ORF.
Ca parait compliqué comme cela mais quand on sait se servir du site, trouver ce que vous demandiez ne m'a pas pris plus que 20 secondes.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
merci encore une fois
j'ai exactement ce que vous m'avez dis et il ya une dif de 2nucléotides ( le votre contien 537nts et le mien 535 nts ) mais je n'arrive pas à trouver l'éreur ceci est important pour la traduction en a.a
et je voudrais aussi savoir comment avez vous trouvé la bonne séquance d'aa conréspondante
merci
Je repris la méthode point par point et je trouve toujours 537. Je ne sais pas pourquoi il vous manque deux nucléotides.
Pour trouver la séquence peptidique j'utilise le programme ExPASy
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
je ne sais pas comment vous remercier j'avait tous ces outils mais ça ne m'a pas suffit pour trouver les bonnes réponses vous m'avez vraiment bcp aidé merci infiniment
Re : Pcr
bonjour !
je voudrai faire une PCR pour chercher la présance de cellules allogénique de souris C57 dans differants organes de souris receveuse Balb /c pour cela j'ai besoin d'acheter des primer du gene H2-b pour cette PCR or je ne c'est pas vers quel fournisseur je peux m'adresser , invitrogen me dit que c'est à moi de construire la séquance génétique des primer mais g peur de faire n'importe quoi pouvez vous m'aider
merci
Pas de conseil de fournisseur sur le forum sinon le message le faisant sera immédiatement supprimé.
Pour la modération,
Greg
bonjour j'aurais besoin de vos lumiéres
je cherche à fabriquer des primer du gene H2-b de la souri C57BL/6 j'ai essayé de faire ce que vous m'avez indiqué lors d'une enciénne conversation mais je n'y comprends rien! pouvez vous m'aider ?!
merci d'avance
bonjour j'aurais besoin de vos lumiéres
je cherche à fabriquer des primer du gene H2-b de la souri C57BL/6 j'ai essayé de faire ce que vous m'avez indiqué lors d'une enciénne conversation mais je n'y comprends rien! pouvez vous m'aider ?!
merci d'avance
Vous n'avez toujours pas réussi à écrire deux oligos?
Suivez pas à pas la démarche que j'avais indiqué (elle est toujours valable, il m'a fallu un court instant pour trouver la séquence de l'histone H2B).
Une fois que vous l'avez, passez la dans primerblast (NCBI). Il va vous sortir des paires (sans doute pas beaucoup) d'oligo spécifiques.
Je vous conseille toutefois de les blaster vous même ensuite (Nblast). Les histones sont pas mal conservés et il doit être difficile de trouver l'oligo archi spécifique.
Si ça n'existe pas (c'est possible). Repérez une région spécifique de H2B, un ou deux nucléotides feront l'affaire et écrivez votre oligo de sorte qu'il se termine en 3' sur cette région. Un seul devrait suffir pour que la PCR soit spécifique. Le hic c'est qu'il vous faut vérifier la spécificité de la région sur tous les histones (le cas échéant pensez aux variants d'histones, et malheureusement il y en a un paquet).
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
bonjour
je crain qu'il n'ai eu conffusion je ne cherche pas à amplifier l'histone H2B mais je cherche à amplifier le gene H-2b de la souris C57BL/6 ( qui est l'équivalent du systeme HLA chez l'homme ) et j'ai fais exactement ce que vous m'avez dit mais ça ne marche pas du tout ! pouvez vous essayer de votre côté
merci d'avance !
