pcr

[invited52a6ce6]

bonjour a tous!!

j'ai une petite question concernant l'identification des amplifiats dans la methode PCR:
dans mon cours j'ai écrit qu'on pouvait mettre en évidence l'amplification grace au bromure d'ethidium qui prend une jolie couleur orange qand il est en contact avec l'ADN... mais dans ce cas, tout l'ADN est orange, pas seulement les amplifiats! comment savoir si la séquence a bien été amplifiée, n'est ce dû qu'a une différence d'intensité de la couleur ou y a t'il autre chose?? (j'ai aussi une allusion a l'electrophorese dans mes notes, mais j'ai du légèrement décrocher a ce moment la...alors si quelqu'un pouvait m'éclairer...)

voila, j'espère avoir été suffisament claire et précise, et merci d'avance!
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[inviteb8b35cb0]

Bonjour Tumnus,

Le bromure d'éthidium a la propriété de s'intercaler entre les paires de bases des acides nucléiques. Lorsque tu faisun gel, tu mets un marqueur de référence qui contient x fragments de différentes tailles connues. Comme tu connais la taille du fragment que tu amplifies, tu veras lors de la révélation sous UV si ton fragment amplifié est au même niveau qu'un des fragments de ton marqueur de référence.

J'espère que ça te convient. Bonne soirée

[invited52a6ce6]

ok, merci beaucoup...
je comprends un peu mieux...disons... un bon tiers de mon cours!!!!

[invite3b51a4cf]

Bonsoir,
Effectivement, la partie concernant l’électrophorèse était importante pour comprendre ! Une fois que l’on a amplifié par PCR le fragment d’ADN que l’on veut, on le visualise en faisant une électrophorèse. Tous les fragments d’ADN sont déposés dans un « puit » situé dans la partie supérieure d’un gel. Le marqueur de référence est placé dans un autre puit situé à la même hauteur. On applique ensuite un courant électrique à ce gel et les fragments d’ADN (naturellement chargés négativement) migrent dans le gel vers la borne positive. Cette migration se fait différemment selon la taille des fragments : plus ils sont petits et plus ils migrent vite vers la partie inférieure et positive du gel. C’est donc au cours de la migration que se fait la séparation entre ton ADN de départ (très grosse molécule qui restera en haut du gel) et les amplifiats (fragments plus petits qui seront plus bas dans le gel). Le BET (ou bromure d’éthidium) va se concentrer au niveau des régions du gel riches en ADN. La détection se fait en plaçant le gel sous une lampe UV qui va révéler la présence du BET par fluorescence. Seules les régions du gel très riches en BET, et donc en ADN, paraitront colorées. Plus on a d’ADN et plus la coloration est intense. Très souvent, la quantité d’ADN de départ est trop faible pour être détectable par cette méthode et on ne verra donc sur le gel que les amplifiats dont on estime la taille par comparaison avec les fragments de référence du marqueur. La réponse à ta question est donc : si l’amplification a réussi, soit on ne voit que les amplifiats, soit on voit aussi l’ADN de départ mais il est placé plus haut que les amplifiats sur le gel.
J’espère que ces compléments d’information seront utiles.

[A voir en vidéo sur Futura]