Bonjour à tous,
Je souhaiterais extraire des protéines membranaires à partir de cerveau congelé à -20°C, quel type de tampon utiliser (NP 40? Triton?), et avec ou sans sonication (pour casser la membrane lipidique des neurones)?
Ensuite j'aimerais faire une co-IPP pour étudier l'interaction entre deux protéines membranaires (la sonication, si présente, ne risque t'elle pas de les séparer? sinon, qu'utiliser?)
Merci pour votre aide car je ne sais pas par où commencer!
Salut,
Le NP40 est trop un détergent trop doux pour moi si tu veux détruire tes membranes. Je travaille sur des cellules en culture donc mon protocole sera légèrement différent, mais si j'étais toi j'essaierais tampon un tampon de lyse 1% NP40 et 1% SDS (il y d'autre composant mais je n'ai pas la liste sous les yeux, je pourrais te dire ça plus tard si tu y tiens). Broie bien ton tissu avant, met le tampon de lyse, cela devrais devenir très visqueux à cause de l'ADN, il faut donc que tu sonique 10s 10% (ou plus si besoin) pour pouvoir reprendre ton lysa. Si la sonication casse les liaisons entre protéines? possible mais je pense pas -> a vérifier.
a+
Merci de ta réponse! ok je veux bien le protocole quand tu l'auras =) EN reveanche je travaille sur des petites zones de cerveau congelé (1 à 2 mg en tube Eppendorf 1,7 mL), donc je ne pense pas avoir besoin de soniquer, qu'en penses -tu? sinon, as-tu un protocole de coIPP? j'en ai déjà mais j'aimerais en tester plusieurs, donc je mets toutes les chances de mon côté!
Sinon je compte faire sur ces mêmes homogénats un fractionnement subcellulaire avec tampon sucrose EGTA MgCl2, inhib proteases, j'ai testé en WB, ma fraction cyto est bien pure (pas d'histones), mais la fraction nucléaire est un peu contaminée par les prot cytoplasmiques (actine notamment), mais il paraît que c'est normal! qu'en penses-tu?
J'effectue aussi des extractions à partir d'échantillons de cerveaux congellés.
On utilise un bloqueur de protéinase dissous dans un tampon tris (TBS). Il en existe de nombreuses sortes, prend le temps de choisir le bon chez ton fournisseur préféré.
Ensuite on utilise un ulta turrax pour brouiller les échantillons (à mon vis, bien plus éfficace que la sonification).
Puis on utilise un détergent pour ouvrir la membrane cellulaire (triton-x, la concentration dépend de la solubilité de ta proteéine).
Tiens moi au courant.
Bonjour,
Pour effectuer une co-IP sur des protéines membranaires, je pense qu'il vaut mieux opter pour un détergent doux. Le CHAPS est souvent utiliser pour les co-IP car il est très doux. Un détergent trop fort dénature les protéines et les interactions entre les protéines sont très sensibles à la structure 3D. Surtout les protéines membranaires qui nécessitent très souvent d'être entourées de lipides pour que leur structure 3D soit maintenu. Il faut donc trouver le bon compromis entre solubilisation de la membrane/maintien de la forme native des protéines. Je te déconseille la sonication qui est dénaturante. Et une agitation forte comme le vortex peut induire une aggrégation du matériel lipidique et protéique donc à utiliser avec précaution.
Merci Nicolas et LXR, donc quelle concentration de CHAPS est couramment utilisée? Pour te répondre Nicolas, ma protéine est un récepteur neuronal au glutamate, donc assez gros (100 kDa)... L'ultra turrax peut-il aussi rompre les liaisons prot-prot, selon toi LXR? Tu me conseilles quoi comme type de traitement alors: vortex léger? LXR, tu utiliserais aussi un tampon type TBS avant la co-IPP?
Tiens tiens, la conversation devient intéressante ^^
100% d´accord! Après comme tu le dis, délicat dosage extraction - solubilisation - protection. Tu devrais essayer sur des échantillons qui ne sont pas précieux à quelle limite de détergent tu arrives à solubiser ton récepteur.Envoyé par LXR
J´ai des collègues qui au lieux de "mixer" à l´aide d´un ultra-turrax, pile l´échantillon dans un mortier. Si ton interaction est faible, cela peut rester une alternative (attention méthode assez longue!)
Je pense utiliser un petit broyeur Potter pour tube Eppendorf, car mes quantités de tissu sont très faibles, seulement 1 ou 2 mg, soit en gros 3 mm^3 !
Je suis désolé je ne peux répondre à aucune de tes questions. A la limite pour le vortex tu peux le remplacer par une incubation de tes lysats sur plateau rotatif dans de la glace pendant quelque temps (je dirais entre 30 minutes et 1 heure).
Sinon consultes des publications montrant des interactions entre récepteurs membranaires. Ainsi tu pourras au moins voir quel tampon de lyse ils utilisent.
Quelques informations : http://www.piercenet.com/Proteomics/...0-455FB515718F
Ici un début de réponse sur la composition de ton tampon de lyse :http://www.protocol-online.org/biolo...osts/6381.html
J'ai trouvé ce détergent : N-dodecyl-ß-D-maltoside, savez-vous s'il conserve les interactions entre deux prot membranaires (récepteur canal + protéine régulatrice)? Car j'ai malheureusement lu que le CHAPS casse les interactions entre les protéines membranaires, donc ce n'est pas bon pour moi ("Useful for solubilizing membrane proteins and breaking protein-protein interactions"). Et si j'utilise du N-dodecyl-ß-D-maltoside, dois-je le mettre avec du SDS par exemple, ou bien simple broyat de mon cerveau congelé, ou ultra turrax?
