ELISA coating et conservation

[TanguyE]

Bonjour,

Je suis actuellement entrain de travailler sur la mise au point d'un test ELISA. Comme j'ai besoin de plusieurs essais et que le coating d'une plaque doit être fait sur la nuit, j'aurais aimé savoir s'il était possible de "coater" plusieurs plaques à la fois et de les stocker pour une utilisation ultérieure.

J'ai lu quelques informations là dessus qui préconisaient de coater les plaques puis le lendemain de faire le premier lavage et de déposer le tampon de saturation (blocking buffer) puis de laisser évaporer à température ambiante. Une fois les plaques "sèches" elle seraient conservables une semaine.

Avez vous déjà utilisé cette méthode? Si non, avez vous d'autres solutions?

Merci d'avance de votre aide

ps: désolé pour les anglicismes, je travaille aux USA en ce moment et j'ai un peu de mal à faire marcher mon cerveau pour la traduction
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[invite5005e1fa]

Bonjour,

Cela depends de ta procedure de coating. Si mes souvenirs sont bons, le protocole traditionnel permet de conserver les plaques pendant longtemps (plusieurs mois) du moment ou elles sont sechent (utilisent un dessicateur par exemple si tu veux en etre certain).
Cela reste toutefois a confirmer/infirmer vu que je n'ai pas coate de plaques depuis un bout de temps.

P.S: Tu travailles ou aux states?

[TanguyE]

Pour ma procédure, j'utilise celle que j'ai vue un peu partout entre les protocoles de la société et les publications, à savoir incubation sur la nuit à 4°C avec 50µl de tampon carbonate-bicarbonate contenant mon antigène.

Pour ce qui est de là ou je travaille, je suis en stage à la fois à l'Université de Floride (Gainesville, FL) et chez Banyan Biomarkers (Alachua, FL)

[invite5005e1fa]

Donc en theorie ces plaques devraient se conserver longtemps a 4C.
Je te conseillerais toutefois d'essayer pour voir la stabilite de ton coating sur une semaine.
Tu pourrais coater 2 plaques, et tu analyses le meme echantillon sur ces plaques. Une premiere fois le lendemain de ton coating, une deuxieme fois une semaine plus tard).
Bonne chance.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite263cfbe5]

Bonjour,

Je suis tombé sur ton post car je travaille sur la mise au point d'un kit ELISA afin de pouvoir le commercialiser.
Je me pose la même question pour la conservation des microplaques. Actuellement, nous utilisons du sucrose que l'on ajoute après la saturation.
On laisses le sucrose plusieurs minutes dans les puits, puis nous les vidons.
On mets à sécher à l'étuve jusqu'à que le fond des puits soient sec.
Mais je voulais savoir si il y avait une autre méthode et si le sucrose était un bon moyen de conserver les microplaques.
Sinon la stabilité des microplaques coatées et saturées est de combien en général ? Quelqu'un le sait il svp ?
Merci d'avance.

[invitee5b7403d]

Bonjour,

Je suis tombé sur cette discussion après une petite recherche. Je travaille aussi sur test Elisa en ce moment, pour déterminer le taux de viroses dans les bulbes d'ail.
Après quelques manip infructueuses (alors que les premières avaient marché), je me suis demandé si ça ne venait pas du fait que l'on congèle les plaques après coating. Les premiers tests réussis avaient été faits sur plaques non congelées.

Pourtant, l'année dernière, les plaques avaient également été congelées, sans aucun problème sur les analyses.
Pensez-vous que selon l'anticorps de coating utilisé (même référence, mais pas même fournisseur), la congélation peut être efficace ou non ?

[invite263cfbe5]

Bonjour,

Je pense que votre problème vient de la congélation. C'est la première fois que j'entend parler de congélation de microplaque.
Le souci avec la congélation, c'est que lorsque vous allez décongeler votre microplaque, il y a de forte chance que votre anticorps coaté soit dénaturé ou fortement détérioré.
Et peut être que selon l'anticorps utilisé, la congélation sera plus ou moins néfaste.
Personnellement, je pense qu'il vaut mieux que vous stockiez vos microplaque dans des sachets d'aluminium avec un sachet déshydratant, plutôt que de les congeler.
Les anticorps n'apprecient guerre les décongélations.

[invitee5b7403d]

Merci pour la réponse si rapide.

Mais dans ce cas, je ne comprends pas pourquoi les tests réalisés l'année dernière ont tous parfaitement fonctionné ? Rien n'a changé (température du congélateur ou autres) ; il n'y a que l'anticorps qui n'a pas été acheté chez le même fournisseur, mais la référence est exactement la même.
On peut voir que la réaction s'opère tout de même, mais très lentement et très faiblement : la révélation prend normalement 15mn, et là on commence à apercevoir une coloration à partir de 45mn. La coloration des positifs reste très faible (environ 0.01 au lecteur de plaques), alors qu'elle devrait atteindre environ 0.1 !

[invite263cfbe5]

Décongelez vous toujours de la même façon vos microplaques ?
Il est possible que le nouvel anticorps supporte moins bien la décongélation. Ce n'est pas impossible.
Ensuite, généralement un test ELISA se révèle au bout de 10-15min. Avec 0.01 de DO au bout de 45 min, votre substrat doit s'oxyder à la lumière et se colorer. Avec le TMB, c'est ce qui se produit si vous le laissez sur la paillasse à la lumière.

[invitee5b7403d]

Ce n'est pas moi qui ai réalisé les tests Elisa l'année dernière, mais apparemment ils les sortaient simplement 10 à 15 minutes avant de les utiliser. C'est donc également ce que j'ai fait dernièrement.

Il est prévu que je teste deux mêmes plaques lundi, une qui aura été congelée, et une autre pas. Je pourrai ainsi me rendre compte si cela vient ou non de la congélation.

Si le problème vient de là, je demanderai à ma supérieure d'investir dans du papier déshydratant, parce que je ne me vois pas préparer mes microplaques chaque matin... Quand vous parlez de sachet aluminium, cela se trouve chez les fournisseurs de matériel de laboratoire ?

En tout cas, je vous remercie pour vos réponses.

[invite263cfbe5]

Le mieux ce sont des sachets d'aluminium, mais actuellement pour d'autres tests de recherche, nous utilisons du papier aluminium simple. Car on en trouve pas partout et ils se vendent en grande quantité uniquement. Pour le papier alu, on entoure les microplaques d'alu et on les conservent dans des bidons hermétiques qui contiennent des sachets déshydratant ou du silicagel (déshydratant).

[TanguyE]

Bonjour,

Je suis allé faire un tour au contrôle qualité de ma boite pour savoir ce qu'ils en pensaient. Donc de ce que j'ai entendu, le mieux est de conserver les plaques coatées et saturées durant une semaine maxi et dans un sachet en alu à 4°C. Le mieux étant d'avoir à dispo une machine "à faire le vide".

Par contre je n'ai jamais entendu parler ni du sucrose, ni de la congélation.

Je commence mes tests la semaine prochaine donc je vais pouvoir en savoir un peu plus sous peu.

[invite263cfbe5]

Je serai intéressé de savoir comment vous conservez vos microplaques. Tu pourras nous tenir informé stp ?

Il doit bien y avoir une autre méthode. Quand on achéte des microplaques pré-coaté (ex : BIORAD, ROCHE ...), la date de péremption est importante.
Mais qu'elle est cette solution...
C'est ce que je recherche depuis plusieurs jours.

[invitee5b7403d]

Bonjour,

Je reviens vers vous, parce que je ne sais plus quoi faire...
Après de nombreuses plaques témoins, avec tous les changements possibles (plaques congelées et non congelées, changement de la solution de lavage, changement de la solution d'extraction...), les résultats de me tests ELISA sont toujours inexploitables !

Je me retrouve avec des témoins négatifs qui sont un coup positif, un coup non sur la même plaque ; je me retrouve avec des blancs positifs également ; avec des positifs négatifs... Enfin bref, je ne trouve aucune logique à ces erreurs !

Tout fonctionnait parfaitement bien l'année dernière, et le protocole n'a absolument pas changé !
Lundi, je réessaierai en changeant toutes mes solutions...

Le problème, c'est qu'en attendant de trouver des résultats corrects sur mes plaques tests, je prends du retard sur mes échantillons à analyser... Et j'utilise des anticorps pour rien, qui coûtent la peau du c..!


Auriez-vous des suggestions qui expliqueraient mes problèmes ?

[invite263cfbe5]

Salut,

Peut être qu'il faut aller à l'origine du problème, à savoir le coating.
Comment procèdes tu pour faire ton coating ? La solution utilisée ainsi que son pH. Tu coates en PBS ou avec du carbonate de sodium ?

[invitee5b7403d]

Pour le coating, j'utilise :
1.59 g de Na₂CO₃ ; 2.93 g de NaHCO₃ ; 0.5 g de NaN₃
Qsp 1 L.
J'ajuste à pH 9.6 si besoin (en général si c'est bien fait le pH est déjà bon).

Je dilue 1 000 fois mon anticorps avant utilisation, je mets 200 µL dans chaque puits, j'incube (selon le moment où je veux récupérer les plaques) soit 3h à 37 °C, soit 4h à 27 °C, soit toute la nuit au frigo (4 °C).

Ensuite, puisque j'ai vu que ce n'était pas cela qui impactait, je congèle mes plaques pour les utiliser plus tard, ou je les utilise immédiatement après 3 rinçages et trempages dans une solution de lavage (1 mL de Tween 20 pour 1 L d'eau distillée).


Je commence sérieusement à désespérer là, je vois pas d'où vient le problème...

[TanguyE]

Salut,

Je viens de lire: "lavage par trempage". Ce qui voudrai dire que tu immerge ta plaque dans ta solution de tween? Si c'est le cas, c'est pas super top comme méthode. Si tu n'as pas d'automate de lavage, tu peux toujours remplir tes puits avec ta solution , les vider en essayant de ne pas transférer de solution d'un puit à l'autre, puis de taper ta plaque contre du papier absorbant pour sécher les puits aux maximum.

Sinon, la congélation des plaques je reste super perplexe mais si tu dis que ça fonctionne alors, pourquoi pas. Par contre ce que je peux te conseiller c'est de saturer ta plaque après coating avant de la congeler et de bien sécher les puits avant congélation.

[invitee5b7403d]

Nous n'avons pas d'automate de lavage, parce que nous ne réalisons les tests ELISA que 2 mois dans l'année.
Ce que je fais, c'est qu'après incubation je vide les plaques fortement, je les claque contre le bord de l'évier, je les remplis de solution de Tween 20, je les laisse 5 minutes avec la solution dans les puits (c'est ce que j'appelle "trempage"), et je les vide et claque contre du papier absorbant comme tu l'as dit. Je répète ça 3 fois.
Pour faciliter les choses, on avait pensé essayer de les sécher avec un sèche-cheveux (mais je sais pas si c'est conseillé ?), parce que le séchage nous prend longtemps...

Pour la congélation, avec quoi penses-tu qu'il faut saturer la plaque ? La solution anticorps ?
Ce que je fais, c'est de congeler la plaque une fois l'étape de coating entièrement réalisée (la plaque lavée et séchée). Je la congèle donc sans solution dans les puits.

[TanguyE]

Ok donc c'est pas un problème de lavage, enfin je pense pas. Pour le sèche cheveux, je crois que c'est faisable, je me souviens l'avoir fait pendant un TP mais je suis pas sur à 100%.

Pour la saturation c'est l'étape la plus importante de ton ELISA. Le principe du coating, c'est que tes protéines (Ac ou Ag) s'adsorbent sur le plastique du puits par des interractions hydrophobes. De ce fait si tu ne sature pas l'espace restant sur le plastique entre tes protéines de coating, le risque c'est que les Ac que tu ajoutes après eux s'adsorbent et du coup faussent tes résultats. La saturation des puits peut se faire avec de la BSA ou des tampons de saturation commerciaux. Par contre il ne faut pas congeler tes plaques avec du liquide dedans.

@Pitch33: J'ai maintenant une bonne idée de la méthode utilisée dans ma boite pour conserver les plaques jusqu'à 8 mois (!!!) au maximum et 4 mois en moyenne. J'ai pas encore testé moi-même car mon protocole n'est pas encore prêt.
Le truc à savoir, c'est que tu ne peux pas prédire si cela va fonctionner, vu que chaque protéine et chaque Ac se comportent différemment. Cependant, depuis qu'elle est utilisée, cette méthode semble ne pas avoir trop de soucis.

La méthode: Coater les plaques selon le protocole utilisé (perso pour moi c'est overnight à 4°), laver la plaque (avec un automate c'est pas plus mal vu que ça permet de sécher les puits au max), saturer selon le protocole utilisé, lavage ((avec un automate c'est pas plus mal vu que ça permet de sécher les puits au max), puis séchage final dans un incubateur à 27° pour enlever les dernières traces d'humidité. Enfin, les plaques sont conservées dans un sachet en plastique/aluminium scellé sous vide.

[invite263cfbe5]

Merci beaucoup pour ses informations importantes TanguyE.
C'est trop tard pour cette fois ci car j'ai commencer ma stabilité avec l'ancienne méthode, mais si les résultats sont pas bon, je vais tester ta méthode auquel j'avais déjà songée.

[invite263cfbe5]

Pour la méthode de séchage au séche cheveux, je te la déconseille. Pourquoi ? Parce que les protéines se dénaturent au alentour de 44°C. Avec ton séche cheveux tu n'as aucun moyen de contrôler ta température. Donc y a des risques que tu abimes sans t'en rendre compte tes anticorps.
En plus, je suis plutôt adepte d'un séchage plutôt long et doux qu'un séchage rapide et trop chaud.
Je te conseille d'utiliser une étuve et tu y mets la température souhaitée.

[invitee5b7403d]

Oui, on a pensé à ça, donc on utilise un sèche-cheveux à air froid (oui oui, ça existe ! ).

[TanguyE]

Bonjour à tous,

Voici les résultats tant attendus de mon test de stabilité:

Grosso modo, je perds environ 0,5 de DO en moyenne sur tous les échantillons. En sachant que pour mes résultats, je passe de 2,5/3 à 2/2,5, ce qui n'est pas plus mal.

Sinon je suis entrain de tester une autre "méthode" que j'ai intitulée "à l'arrache". En effet, suite à une erreur dans mes préparation, je me suis retrouvé avec une plaque 96 puits entièrement coatée alors que j'avais absolument besoin de strips . Du coup je vais en profiter pour voir ce que ça donne juste en scellant la plaque avec un adhésif après saturation et lavage et en conservant à 4°C. (J'essaye de me rassurer en me disant que beaucoup de découvertes sont dues à des erreurs )

Enfin, dans le cadre de mes recherches, je vais commander un kit "commercial", je vais donc essayer de voir ce qu'ils ont fait pour la conservation.

La suite au prochain épisode...

[invite263cfbe5]

Salut à toi,

Oula tu as des DO bien élevées ! Fais attention de pas être trop fort, car généralement il y a une limite de linéarité sur les lecteurs de plaques. Au dessus de 2 voir 2.5 en DO c'est pas top top.
Je viens bien avoir tes infos si tu arrives à les avoir concernant ton kit commercial. Mais à mon avis c'est pas gagné ^^ Secret professionnel oblige.
Moi je vais préparer un test de stabilité en sachet alu avec déhydratant. On verra ce que ça donne.

[TanguyE]

Oui mes DO sont super élevées et pourtant normalement mes conditions sont reglées pour tomber entre 2 et 1,5 avec l'antigène commercial. Mais comme j'ai fait des tests avec une protéine "maison" et une protéine commerciale pour voir la différence, les puits avec la protéine maison crachaient de la couleur à mort (ce qui était prévisible vu mes résultats de Western, mais j'avais aucune idée de ce que ça donnerai comme augmentation en ELISA).