Transcription in vitro de sondes ARN marquées

[invite10adf645]

Bonjour à tous,

j'aurai bien besoin de l'avis d'un expert en biologie moléculaire ! Je cherche à synthétiser des sondes ARN marquées à la DIG ou à la biotine pour faire de l'hybridation in situ.
J'ai extrait des ARN à partir du tissu cible, fait une RT puis une PCR avec des primers couplés à des promoteurs T3 ou T7. J'ai fait migrer les produits, extrait l'ADN sur gel, et fait une deuxième PCR sur cet ADN.
Jusque là tout va bien, à part peut-être de légères bandes trop hautes sur ma deuxième PCR. Ce qui est assez étrange vu que j'ai extrait l'ADN sur gel (j'ai isolé ma bande d'intérêt), et qu'elles n'apparaissaient même pas sur la première PCR avec des cDNA totaux !
Enfin bon, je lance ma transcription et j'ai des super rendements, les DO sont impeccables. Par contre à la migration de ces ARN après purification (lithium/ethanol) je vois des smears, et quelques bandes secondaires apparaitre ! Le poids moléculaire de mes transcrits est aussi plus haut qu'attendu (peut-être à cause de la DIG ou de la biotine ?).

Bref, je ne sais pas quoi en penser et j'aurai bien besoin d'un avis là dessus.

Pour plus de clareté j'ai joint un petit PDF où toutes les étapes sont résumées avec les photos des gels (en anglais, sorry).

Merci beaucoup pour votre aide !

Fanou
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[piwi]

Rien d'absolument inquiétant. Les ARNs se replient en formant des structures secondaires qui modifient leur PM apparent et qui font que l'on observe plusieurs bandes sur gel d'agarose. En général, il y en a quand même une majoritaire pratiquement toujours à un PM différent de celui attendu.
Pour éviter cela il faudrait se mettre en conditions dénaturantes. Aucun intérêt ici.

Cordialement,
piwi

[invite10adf645]

Merci piwi pour ta réponse super rapide (et rassurante) !

Tu penses que je peux lancer mes tests d'hybridation quand même ?

J'ai pourtant dénaturé mes échantillons 10min à 70°C (puis glace) avant l'électrophorèse. Il faudrait donc carrément faire une migration en agarose + formaldehyde ?
On n'utilise plus de bromure d'ethidium au labo, et je ne sais pas comment le GelRed se comporte en conditions dénaturantes. Je ne connais pas non plus la composition du Tp de charge fourni (c'est là que les solutions alternatives au BEt pêchent...).

Merci encore anyway !

[piwi]

Pourquoi "quand même"? Oui tu peux poursuivre, ce que tu observes est normal.

Sinon, si tu veux vraiment être en condition dénaturante c'est bien en formamide que ça se passe. Encore une fois, ça n'a aucun intérêt ici.

Juste pour précision, histoire de bien te rassurer, nous faisons des in situ pratiquement chaque semaine au labo.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite10adf645]

Me voilà donc complètement rassuré alors !

Je vais me contenter de ma sonde "sens" comme contrôle négatif et oublier l'électrophorèse dénaturante.

Mille mercis !