ImageJ

[invitef08e6467]

Salut à tous,

J'ai vu un bon paquets de sujet sur imageJ mais ma question est un peu différente.

Voilà l'historique complet : j'utilise un marquage fluorescent pour détecter une espèce réactive de l'oxygène. D'après la publi d'origine et son auteur avec qui j'ai pris contact la quantification se fait par dénombrement du nombre de pics de fluorescence. Chaque pic correspondrait à une cellule. D'après mes résultats il ne s'agit en aucun cas de cellules et j'en suis arrivé à remettre en cause ce dénombrement.

Pour palier à ce manque de quantification j'ai réalisé des photos de mes organismes entiers (plathelminthes) et ce avec des réglage d'appareil fixes (même iso, même temps d'exposition...). J'ai passé les photos sous imageJ (témoins et condition exp) et j'ai détouré l'animal. j'ai pris une mesure de la moyenne de gris et la surface totale. J'ai donc une valeur de fluorescence donné par le ratio luminosité/surface.

Je suis certain que cette méthode fonctionne bien mais je n'arrive pas à trouver de publications ou cette méthode est utilisée. D'où ma question : Connaissez vous des gens ayant utilisé cet "indice" et si oui pouvez vous me donner une référence que je pourrais citer.

Merci par avance.

PS : je peux accessoirement mettre quelques photos de mes résultats...
-----

[Flyingbike]

il s'agit de quoi alors, de zones subcellulaires ?

je ne suis pas sur que tu doives absolment justifier ce type de quantification (intensité globale), étant donné que c'est une technique assez utilisée (je pense).
Sinon, pourquoi ne pas quantifier en mesurant le nombre d'évènements positifs après avoir défini un seuil ?

[invitef08e6467]

Voila une portion de mon ver. J'ai pas l'impression qu'il s'agisse de cellules (mais pour le moment je cherche encore le "comment ça marche?") pour plusieurs raisons, notamment le fait que la drogue que je teste réagisse avec le contenu digestif et c'est cette réaction qui génère des ROS. Quoi qu'il en soit même s'il s'agissait de cellules, vue la quantité j'aurais du mal à dénombrer. Sur la photo vous avez une portion de ver qui correspond à 5% de son corps à peu près.

La quantification par cette méthode me paraissait pas mal et donne de bons résultats.

Merci pour la réponse.

[Enialix]

Salut,
je ne peux malheureusement pas t'aider, par contre j'ai une question, quelle est la sonde que tu utilise et quelle ROS reconnait-elle? Je travail sur cellules et je voudrais voir si je peux l'utiliser aussi.

Merci d'avance.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef08e6467]

Pouah j'ai essayé pleins de trucs!!! Celle de la photo c'est du DAF-2 (diaminofluoresceine) et ça détecte le NO. Protocole très facile, j'ai quasiment pas eu de mise au point à faire. t'en trouvera chez Sigma si je ne me trompe.

Ensuite sur cellule j'ai essayé le NBT (nitro blue of tetrazolium) qui détecte l'anion superoxyde (dosage de l'absorbance au spectro à 610 ou 620 nm) mais celui là tu dois le connaitre. Le mieux pour celui là c'est de faire réagir puis de lyser les cellules et doser les surnageant

J'ai également testé un kit sympa l'amplex red qui dose H2O2 (également au spectro 560nm). Pour celui là il s'agit de doser le relargage en cinétique. Mais tu peux également doser en point final après lyse comme le NBT.

[gorben]

Tres franchement, la methode est simple et logique, pas besoin de citer une reference. Tu as juste a dire que tu as selectionne ta ROI manuellement puis que tu as fais la moyenne de l'intensite puis normalise par la superficie.

Pour moi, juste un bemol : la moyenne de l'intensite, c'est bien la somme de l'intensite de tous tes pixels divise par le nombre de pixel? Dans ce cas, pourquoi re-diviser par la superficie? Tu l'as deja fais une fois en calculant la moyenne...

A+

[invitef08e6467]

Salut,

En effet tu as raison j'ai pas besoin de rediviser par la surface... du coup mes résultats sont encore plus jolis!!! Merci beaucoup.