Faire du pGEMT soi-meme

[invite662eeae6]

Bonjour,
je dois cloner énormément de séquences et comme mes moyens sont limités pour ce projet, j'ai l'intention de créer mon propre kit de clonage.
Bactéries thermocompétentes : c'est bon,
vecteur pGEMT : je l'ai récupéré dans une colonie bleu, je l'ai ouvert avec EcoRV et maintenant il faut que je rajoute un T aux extrémités. Pour cela j'ai une Taq et des dTTP mais je ne sais pas quel programme PCR utiliser. Combien de cycles? a quelle température d'hybridation? quelle durée d'élongation?
Vos idées et conseils sont les bienvenus
Merci
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[piwi]

Je crois que l'idée pour créer les T sortants est d'utiliser une enzyme de restriction type XcmI en adaptant la séquence de restriction.
http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0533.asp
Il faut donc insérer une telle séquence de restriction en utilisant des oligonucléotide par exemple.

Sinon, on doit pouvoir bricoler un truc avec une terminal deoxynucleotide transferase. Mais y aura sans doute pas mal de mise au point. Peut rentable donc.

Cordialement,
piwi

[invite71f23525]

Il me semble que cette méthode de clonage s'appelle le TA cloning. En faisant une recherche avec cette expression, tu devrais tomber sur les compagnies commercialisant des kits sous cette appellation. En recherchant de façon approfondie, tu devrais pouvoir te procurer le protocole ou au moins le principe de la méthode.

[piwi]

Oui c'est bien cela. Du TA cloning. Plusieurs boites proposent ce genre de vecteurs déjà préparés. Le but de cette discussion est justement de préparer soit même de tels vecteurs afin d'avoir à éviter de les acheter. On peut encore noter qu'il existe aussi du GC cloning.
Maintenant, pour les produire, je pense que la méthode est celle que je décris, à savoir utiliser une enzyme de restriction qui génère un T sortant. Je ne vois pas vraiment de méthode biochimique intéressante qui permette un bon rendement de production de vecteurs.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

Il me semble (décidément j'évite les certitudes dans ce sujet ) que les Taq ont une activité terminal transférase. Il suffit de faire une polymérisation avec une Taq dépourvue de son activité 3'->5' exonucléase pour que le T sortant ne soit pas excisé. A vérifier.

[piwi]

Pas certain de comprendre la stratégie que tu as en tête. La taq est supposée faire quoi?
En fait, la Taq ajoute des A (certaines Taq modifiées ajoutent des G). Du coup, c'est le fragment PCR qui a des A 5' sortants.
Le but du TA cloning est d'avoir un vecteur déjà linéarisé avec des T 3' sortants qui va permettre de liguer directement la PCR sans passer par une étape de restriction.
La difficulté est que les sociétés qui les proposent s'arrangent pour qu'une fois le vecteur recircularisé, il ne puisse pas être relinéarisé en régénérant les T 3' sortants. Il faut en reacheter.
Pour en créer un soit même, il faut donc trouver le moyen de générer un plasmide qui peut être linéarisé en générant les extrémités T 3'. La méthode que je préconise est d'utiliser XcmI. Je me suis d'ailleurs amusé à chercher XcmI + TA cloning et ma méthode est bien maligne puisqu'elle est publiée
www.ias.ac.in/jgenet/Vol83No1/33.pdf

Voilà qui devrait répondre parfaitement à notre question

[invite71f23525]

D'accord j'ai compris!

Au passage, j'ai rarement vu une publie aussi courte! Mais j'en prends note au cas où plus tard ça me servirait.

[invite662eeae6]

Merci de votre aide.
Je m'y attèle de ce pas!

[gorben]

Salut,

Pour ma part je partirais sur une strategie differente. Tu peux faire une amplification lineaire (50 a 100 cycles avec une enzyme HF et tres thermostable) d'un plasmide avec une amorce contenant un T sortant. En 2 PCR tu as assez d'ADN simple brin pour reformer une grosse quantitee de vecteur. Tu digeres DpnI, une purif sur gel (ou pas) et apres rehybridation des deux simples brin tu te retrouves avec une jolie quantitee de vecteur contenant des T sortants.

A+

[piwi]

Je capte pas trop.
Tu linéarises le plasmide tu mets tes oligos avec tes T sortants et tu fais une long range. Jusque là je suis.
En sortie de PCR tu obtiens le vecteur double brin avec des T-A à la fin. Le T ne reste pas simple brin.

Enfin, DpnI ne va digérer que les sites G_mATC. C'est à dire qu'il va mettre en morceau le plasmide matrice obtenu en bactérie. Je ne vois pas spécialement l'intérêt ni comment on se retrouve à la fin avec un T sortant.

Cordialement,
piwi

[gorben]

Hehe je me suis rendu compte un peu trop tard que j'etais pas tres clair
La PCR faut la faire avec une seule amorce (d'ou le lineaire). Tu te retrouves avec du simple brin que tu dois purifier (et/ou digerer par DpnI). Une fois que tu as du simple brin "pur" il faut refaire du double brin et tu as un vecteur avec des T sortant presque pur. Je trouve (experience perso) que pour ce genre de chose la PCR est plus facile a maitriser que la digestion (on sait jamais vraiment si ca coupe a 100%, et il suffit d'un peu de template pour gacher une experience).

Avec 50 a 100 cycles, le rendement PCR lineaire est pas trop mauvais. En partant d'une dizaine de ng de plasmide tu arrives a pas loin de 1ug (en theorie).

A+

[invite71f23525]

D'après ce que je comprends, tu peux faire les T sortants qu'en 5' sur les vecteurs avec la méthode de PCR. Donc je suppose que les inserts il faut leur ajouter en 3' des A sortants avec la terminal transférase pour qu'ils se liguent à tes vecteurs?

[gorben]

Oui tout a fait, une terminal transferase ou encore plus simple, juste une taq ca devrait le faire.

A+

[invitee170a0e7]

@BMeuse : en tout cas si tu obtiens une bonne quantité de vecteur, et stable, n'hésites pas à venir le dire ici ^^

Oui je suis également intéressé. Après la Taq maison, le kit de purif' sur colonne maison, les bactos compétentes... avoir un vecteur maison pourrait être pas mal. Les affres des petits labos (mais du coup, le système D et les trucs & astuces tournent à plein régime)