extraction et séparations des composants d'une membrane

[invite539c2943]

Salut à tous!
pour mon premier post j'ai une petite question protocolaire

Voila je connais quelques techniques d'extraction des composés membranaires (sonication, détergents...).
Mais je n'ai malheureusement pas réussi à trouver comment séparer lipides et protéines libres obtenus, histoire d'obtenir une solution de lipides uniquements.
J'aimerai savoir si il n'existe que les techniques de chromato ou si vous en connaissez d'autres et si vous en avez les protocoles...

toute information (liens, docu ou n'importe quoi )sur le sujet quelle qu'elle soit sera la bienvenue.
merci d'avance...

(et au passage bravo pour la qualité des post et des réponses de ce forum.)
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[invite7500bbe7]

Ce n'est pas l'electrophorèse qui fait ça?

Je ne suis pas expert dans ce domaine j'absorbe surtout les résultats...

[invite5005e1fa]

Salut,
par éléctrophorèse tu vas réussir à séparer les proteines entre elles non?
Mais il ne serais pas possible de faire précipiter les proteines ? (éthanol par exemple) ou de solubiliser les lipides (hexane).
Enfin, je ne suis pas un spécialiste non plus, ce ne sont que des idées à chaud...

[invite7500bbe7]

oui on peut faire cristaliser les protéïnes c'est un chalenge interressant et difficile...l (il y a ça au labo) l'electrophorèse c'est surtout pour les séparer, les ponctionner et les analyser. (en masse haute résolution par exemple, c'est ce qui est fait au labo)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite539c2943]

d'abord merci de vos réponses!!

L'éléctrophorèse va effectivement permettre de séparer les protéines (ne marche que pour les molécules chargées), ca pourrait peut etre marcher pour séparer les lipides non chargés des protéines mais ca a l'air difficile à mettre en oeuvre car on la pratique sur un gel avec de petites quantités non? Or je recherche un méthode capable de fournir au moins 1 ml de solution de lipides (si ce n'est plus).

L'idée d'une précipitation des protéines a par contre l'air interessante je vais essayer de creuser dans cette voie la, couplée à une solubilisations des lipides ca pourrait donner des résultats interressants mais je ne suis vraiment pas expert dans ce domaine et je ne dispose que du labo du lycée!!!

En fait l'idée serait d'obtenir une phase uniquement composée de lipides et une autre avec le reste, pour pouvoir ne récupérer que les lipides dans le but de former une membrane artificielle sans protéines.

mais que pensez vous d'une chromatographie sur colonne??
Le gros problème est de savoir quand et dans quel ordre les molécules différentes arrivent en bas et surtout de trouver le matos.

[invite7500bbe7]

Je crois qu'au labo ils font effectivement précipiter les protéïnes...j'en suis sur même, le MO je retiend pas ces trucs là...en bio, cristallo, chimie, in vivo, in vitro...je m'embrouille la cervelle...ça dépend des protéïnes utilisées, etc...c'est un peu comme en chimie ou bioanalyse, complexe quoi.

Tu veux être chercheur, alors cherche...(ici on me disait le contraire, ne cherche pas trouve...mais quand on a trouvé c'est fini, je préfère chercher...)

[invite38d526e0]

Bonjour,

regarde du coté de la méthode de Folch (extraction des lipides en mélange méthanol chlorophorme)

bon courage

[invite539c2943]

pour Fafapas: Merci de ton aide
bon c'est vrai que c'est plus marrant de chercher mais il faut bien trouver un jour hein !!
En tout cas je ne pose jamais de questions sans avoir un minimum cherché avant!!!
Je n'attend pas une réponse totale à ma question mais juste des pistes, que j'ai d'ailleur obtenu (et encore merci).
Deplus je trouve qu'il n'est rien de plus plaisant que de trouver après avoir cherché. quel interet j'aurai à obtenir une réponse directement??

pour Goupil: je vais chercher de ce coté la. Merci

[invite7500bbe7]

te fache pas...je plaisantais, je t'aurais répondu après avoir questionné des collègue dont c'est le métier mais je dois travailler un peu aussi...la question me parait un peu vague, les experts je sais comment ils répondent...après je comprend encore moins...et pourtant c'est mon job!


Je questionnerais dès que je croise un cristallographe...à l'heure du café sans doute.

Excuse de l'aggréssion

[invite539c2943]

Ne t'inquiète pas, je ne suis pas faché, je prefère juste clarifier les choses.lol. IL y a trop de gens qui croient que tout va leur tomber tout cuit dans la bouche...(enfin on va pas faire de débat idéologique la dessus on est sur un forum scientifique!! )

Je comprend que tu trouve mes questions vagues, j'ai moi meme un peu de mal à m'y retrouver,!!! en tout cas merci beaucoup pour l'aide déjà apportée et t'enquiquine pas avec ca ...c'est pas vital comme question

Je vais essayer de clarifier tout ca , ca risque de me prendre un petit moment...

@+ (joke)

[invite7500bbe7]

Finalement la réponse à été simple...je l'ai posée à un bioanaliste (plus simple qu'un cristallographe): tu met du methanol, les protéïnes précipitent, tu centrifuges ( ultracentrifugeuse) et voilà.

On peut aussi jouer sur le pH...

[invite539c2943]

merci c'est vraiment sympa de ta part!
T'as l'air d'avoir pas mal de contacts.lol
Cette methode a l'air d'etre la plus simple

Pour la methode de Folch, je me suis renseigné, et effectivement c'est une bonne methode, mais pour un micro-echantillon il faut chauffer le tube en pyrex à 550°c toute la nuit, et ca va etre dur de négocier ca avec le chef de labo du lycée

voici le lien vers les protocoles:

http://www.ifremer.fr/drvraarn/docum...DES_TOTAUX.pdf


Merci de cette idée

@+

encore une fois je suis soufflé de voir la qualité des réponses!!

[invite27acb9c8]

Salut,
Si ton but est de faire une membrane artificielle (sans protéines) le mieux est de partir de faire des phospholipides (glycérol + acide gras en quantité en défaut puis phosphorylation via kinase = ATP....; = p-t un peu compliqué) ou une molécules apparentées (amphiphiles). Il fau t ensuite s'arranger pour avoir un système diphasique (tes molécules se mettent à l'interface)... puis tu évapore le solvant organique... de façon à obtenir une monocouche puis (CMC) des micelles...
Enfin si tu veux extraire les prtotéines membranaires, si tu précipites... les protéines , je crois que tu précipites aussi les lipides...puisque en fait les protéines membranaires sont toujours (à ce stade) accompagnées de lipides et de détergents dans des structures de type micelle... donc pas facile!!!
Une solution est de faire une chromato sur résine échangeuse d'ions (à condition d'avoir utilisé" un détergent non chargé (urée, triton...) ... car alors, même si tes prot sont dans des micelles, la micelle aura une charge si elle contient une ou plusieurs protéines. Elle sera donc retenue et les lipide seront éliminé. (puis désorption avec effet de contre ion... en augmentant la force ionique). Le tout est d'avoir des micelles de petites tailles..; donc il faut jouer sur la l'agitation avant chromato, sur le type et la concentration en détergent, sur la force ionique...
Et même dans ce cas, il reste des lipides!
Ou alors il faudrait trouver un solvant "apolaire" qui solubilise la protéine hydrophobe et les lipides puis faire une précipitation défférentielle (mais jamais entendu parler... j'ai pas beaucoup d'expérience non plus...).
voilà bonne chance

[Abricote]

Finalement la réponse à été simple...je l'ai posée à un bioanaliste (plus simple qu'un cristallographe): tu met du methanol, les protéïnes précipitent, tu centrifuges ( ultracentrifugeuse) et voilà.

On peut aussi jouer sur le pH...

Une idée juste comme ça: tu pourrais faire agir des phospholipases avant le méthanol + centri: ça te permet de décrocher les protéines périphériques. Tu auras ainsi 2 étapes de purif et (j'imagines) un échantillon de lipides plus "pur".