recombineering...

[invite42d63320]

bonjour,

je suis actuellement en train d'effectuer un petit projet, et je me retrouve confronté a un petit problème...

en effet, je dois effectuer un recombineering, il n'est pas nécessaire d'avoir des connaissances sur cette technique pour répondre a cette question...
je vais donc introduire un gene rapporteur dans un exon d'un ARN non codant, mais qui est tout de même transcrit (mais, donc, non traduit...). et j'ai cherché sur internet, mais je n'ai pas trouvé la réponse à ma question qui est la suivante... oups, pardon, en fait il y a deux question...
puisque le gene est dans un ARN non codant... comment je fais pour l'introduire selon le cadre de lecture ??? puisque il n'y en a pas... je l'introduit n'importe comment ???
et sinon, puisque il n'est pas traduit, comment je fait pour initier la traduction de mon gene rapporteur ? y a t'il possibilité d'avoir un protocol quelque part s'il vous plait ?

dans l'attente d'une éventuelle réponse de votre part, je vous remercie tout de même d'avoir consacré du temps a la lecture de mon problème...

bonne journée et bon week-end
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[invite02e16773]

N'est-ce pas possible, à l'inverse, de faire une construction rapporteur+séquence cible de l'ARN non codant, et donc de repérer la transcription de ton ARN d'intérêt par extinction de l'activité du promoteur ?

[invite42d63320]

si j'ai bien compris ton message, guillaume, effectivement, c'est une idée intéressante, mais j'ai oublié, et je m'en excuse, de spécifier que je vais le faire sur la drosophile, ducoup, si je veux repérer l'extinction de mon rapporteur, je vais avoir du mal a trouver les zones " éteintes " sur une mouche complètement "allumée"... (c'est même carrément impossible...)
merci pour la réponse anyway

sinon je me suis rappelé des séquences IRES, faudrait que je me renseigne un peu plus pour savoir si ça marche sur la droso. et comment l'intégrer a mon rapporteur et puisque c'est inefficace chez les procaryotes (apparemment), pour le " contrôle " je vais devoir creuser un peu plus...

[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Tu peux peut-être effectuer l'insertion d'un gène rapporteur qui est en fusion avec une région 5'-UTR, si cela se trouve...Ainsi ton rapporteur bénéficiera des séquences d'initiation de la traduction requises pour sa traduction.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite42d63320]

merci LXR c'est sympa
cependant, les ressources que nous possédons pour le moment ne me permettent pas d'introduire la séquence du rapporteur au début de l'ARN non traduit, car les mutants disponibles pour l'intégration du gène rapporteur sont limité(nous utilisons des attP-attB), donc je n'ai qu'un exon disponible au milieu de l'ARN. et comme nous le savons, l'initiation de la traduction par 5'-UTR ne se fait que au tout début du messager (5') car les ARN polycistroniques n'existent pas chez les eucaryotes. si j'ai bien compris ce que tu voulais dire.
mais peut être que je pourrais faire la construction suivante :
-(region 5'-UTR procaryote(shine-dalgarno))-(initiateur mystère pour droso.)-(rapporteur)-
et ainsi avoir un visu de mon gène rapporteur aussi bien lorsque je construirais mon plasmide dans les bactéries, que lorsque je l'aurais injecté dans mes drosophiles... mais de toute manière je vais faire des digestions ( enz. de restrictions ) et des PCR pour vérifier mes constructions plasmidiques ce qui serra, je pense un peu plus rapide, moins complexe et plus sûr.

[invite3c235e37]

Bonsoir,
Si j'ai bien compris, tu veux vérifier l'expression d'un ARN non codant dans tes drosophiles en utilisant un gène rapporteur.

l'initiation de la traduction par 5'-UTR ne se fait que au tout début du messager (5') car les ARN polycistroniques n'existent pas chez les eucaryotes

Et n'oublions pas qu'il faut une queue polyA, ce qui n'est pas le cas des ARN non traduit...

mais peut être que je pourrais faire la construction suivante :
-(region 5'-UTR procaryote(shine-dalgarno))-(initiateur mystère pour droso.)-(rapporteur)-

Le problème, c'est que je ne suis pas sure que les ribosomes eucaryotes peuvent initier la traduction sur un signal procaryote (Shine-Dalgarno).
Par contre l'idée d'utiliser une séquence IRES semble plausible, se système existant bien chez les droso (voir Pubmed: drosophila ires). Tu pourra tester ta construction chez la levure ou autre culture cellulaire avant de te lancer, pour voir si ton rapporteur est bien traduit...

[invite3c235e37]

Ah, et j'ai juste une petite question de vocabulaire: peut-on parler d'exon lorsqu'il s'agit d'ARN non codant?

[invite02e16773]

Ah, et j'ai juste une petite question de vocabulaire: peut-on parler d'exon lorsqu'il s'agit d'ARN non codant?

On parle d'exon et d'intron lorsqu'il y a un processus d'épissage.
A ma connaissance certains ARN non codants sont issus d'introns d'ARN codants : donc dans ce cas là on parlera d'intron, oui.

[invite42d63320]

Ah, et j'ai juste une petite question de vocabulaire: peut-on parler d'exon lorsqu'il s'agit d'ARN non codant?

effectivement, car l'ARN est transcrit, puis épissé (c'est a dire que des morceaux sont enlevé) et pour finir, il reste dans la cellule... donc il faut faire attention ou on place le gène rapporteur, pour éviter de le perdre.
il ne faut pas oublier de plus qu'il existe des ARN non codant qui ont un rôle catalytique ou structural, comme par exemple les ARN de ribosomes, les ARN interfèrent, les micro-ARN, les ARN tête de marteaux etc...

mais en tout cas merci beaucoup RiboGab pour l'idée de la levure, je n'y avait pas pensé, mais c'est vrai que c'est un choix judicieux pour tester mes montages.

par contre pour la queue poly-A, je pensais qu'elle était toujours produite, tout comme la région UTR-5'

je ne connais pas la proportions d'ARN qui n'ont pas ces structures, mais je pense que je vais partir du principe que mon ARN les contient, et je vais juste mettre une séquence kozak bien placée avant le rapporteur peut être, mais des gars de mon labo me disent que c'est pas la peine, car parfois ça fonctionne sans... je vais lire plus de papiers et je verrais bien...

merci a tous en tout cas !!!

[invite3c235e37]

par contre pour la queue poly-A, je pensais qu'elle était toujours produite, tout comme la région UTR-5'

Pour ce qu'on en sait aujourd'hui, seul les ARN messagers produit par l'ARN pol-II sont poly-adenylés, et encore, pas tous (par exemple les ARNm des histones ne le sont pas). En générale, les ARN non codant ne sont pas poly-adenylé, ou alors c'est un signal de dégradation (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20062005).

[invite42d63320]

ok..... donc je suis dans l'embarras lol, je vais voir si j'ai plus d'info sur cet ARN, sinon il me reste les IRES, mais d'après ce que j'ai lu pour l'instant, visiblement, il existe beaucoup de différents IRES, et certain (voir tous, je sais pas encore...) nécessitent des facteurs pour fonctionner nommé iTAF... je vais me renseigner.

merci en tout cas...

[invite3c235e37]

Oui il y a beaucoup d'IRES, mais pour se qui t'intéresse je pense qu'un IRES viral, du genre EMCV fonctionnerait très bien (c'est un IRES très puissant). Pour les ITAF, il y a différentes classes d'IRES qui requièrent différents ITAF, mais en général l'IRES d'EMCV marche partout (je crois...). Regarde se qui a déjà été fait, il me semble que j'ai vu quelques études chez la droso sur pubmed...
Bon courage

[invite71f23525]

En remplacement de la queue polyA, tu peux ajouter l'intron de SV40 qui se place en 3' de ton gène rapporteur. En effet cet intron est épissé et l'épissage favorise l'export de l'ARNm du noyau. Cela pourra compenser l'absence de queue polyA qui favorise elle aussi l'export du noyau. Une fois dans le cytoplasme, ton ARNm sera moins stable que s'il avait une queue polyA, il sera plus rapidement dégradé par des exonucléases. Toutefois, s'il est bien exprimé, le signal de ton rapporteur pourra être suffisant.

Une précision : tu veux faire une sorte de knock-in ou tu veux construire un plasmide que tu transfecteras dans tes cellules, car tu as aussi parlé de plasmide...?

[invite42d63320]

COOL !!!
merci beaucoup pour toutes ces idées, je vais donc potasser tout cela.

Une précision : tu veux faire une sorte de knock-in ou tu veux construire un plasmide que tu transfecteras dans tes cellules, car tu as aussi parlé de plasmide...?

c'est un knock-in avec un plasmide...
en fait je vais injecter ma construction plasmidique dans des embryon de mouche muttante, car elles possèdent un site " attB " a l'endroit désiré, et sur le plasmide, il y a un site " attp " (c'est un peu le même principe que lox P avec Cre, mais c'est énormément moins réversible, et plus spécifique.) le but est de toucher les cellules germinales... et ensuite je ferais des croisement avec un Wild Type, et j'aurais une bonne proportion d'hétérozygotes pour l'analyse de mon gène rapporteur.