Bonjour,
Je cherche à mettre en évidence la forme phosphorylée (Ser1981) de la protéine ATM dans des cellules MEF, par western blot.
J'ai déjà testé de nombreux protocoles sans succès (méthodes d'extraction différentes, migration sur petit/grand gel, transfert liquide/semi-sec..), donc j'aimerais savoir si quelqu'un possède un protocole précis ou des indications ?
Merci
quel est le problème ? en western, tout peut être une source de problème..
A la révélation, je n'ai aucune bande ou au contraire quelque fois j'ai des bandes intéressantes mais qui ne correspondent pas à la taille de la protéine (250kDa). (L'anticorps utilisé est celui qui est le plus abondant dans les publications)
Et, ATM est une grosse protéine, très peu abondante. Y a t-il une méthode d'extraction à privilégier ? de migration et de transfert ?
l'idéal est d'avoir une protéine recombinante ou un modèle ou elle est surexprimée comme contrôle positif.
Sache que le transfert des grosses protéines n'est pas très facile, il faut souvent ajuster le ratio ethanol:SDS.
Il faut aussi être sur que la protéine rentre dans le gel au moment de la migration, tu devrais essayer si ce n'est pas déjà fait un gel moins concentré (genre 7% mais c'est de la vraie morve)
Si la protéine est nucléaire, tu devrais essayer de faire des extraits de protéines nucléaires pour enrichir ton extrait.
Est ce que tu arrives à voir la protéine totale (non phosphorylée) ?
J'ai déjà essayé avec une lignée cellulaire déficiente pour ATM, mais sans succès.
Et au niveau blot, j'ai déjà essayé pas mal de paramètres : petit/grand gel, faible pourcentage d'acrylamide (6-7%), transfert liquide éthanol/méthanol avec différents temps et voltage...
Je n'arrive pas non plus a voir la protéine non phosphorylée (car trop de bruit de fond)
Est-ce que tu connais quelqu'un qui a déjà fait un blot d'ATM ?
non je ne connais personne.
Ce que tu peux essayer :
-transfert overnight à 4° et genre 4V
-blocage en lait 5% ou BSA 0,5% ou les deux
-pareil pour les sauces d'anticorps (lait ou BSA)
-charger plus de protéines
Tu fais un rouge ponceau apres transfert ?
tu as des protéines transférées à cette taille ?
ok je vais essayer.
Généralement, oui, j'ai des protéines transférées à cette taille.
Je te remercie pour tes conseils
Est-ce quelqu'un a déjà utiliser l'anticorps ATM-P1981 de Rockland ?
Car j'ai des bandes qui se différencient entre les cellules témoins et traitées mais pas au bon poids moléculaire ??
C'est à dire? Le poids moléculaire est un peu relatif en WB.
Sinon, vous êtes en culture cellulaire. Qu'est ce qui vous empêche de faire une grosse quantité de boite, d'extraire vos protéines pour les concentrer.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
La protéine apparait autour de 100kDa au lieu de 370kDa. Je voulais savoir si quelqu'un avait déjà ce problème avec cet anticorps.
Et je travaille déjà sur du 400ug/puit.
400µg/puit!!!
Là en revanche c'est beaucoup trop. D'une part, ca doit migrer n'importe comment dans vos gels, et d'autre part ca doit géner la reconnaissance des anticorps. Parfois moins est mieux que plus. Diminuez, même drastiquement. Essayez 10µg, 20µg, 40µg. Vous aurez peut être des surprises.
Pour l'écart de taille, il est évident qu'il y a un problème. Mais pas de conclusions attives, attendons déjà de voir ce que donnent vos gels avec moins de protéines.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Je plussoie infiniment piwi, certains de mes westerns (concernant des protéines peu exprimées) se sont résolus simplement en chargant moins (par exemple 120µg avant, 10 après)
