TP de Biochimie

[invite4f2a033f]

Bonjour,

Je suis en train d'effectuer un TP de biochimie qui me pose problème.

Il faut savoir que dans ce TP, nous voulons extraire le lysozyme du blanc d'oeuf. Pour cela nous faisons des chromato d'échangeuses d'ions (ainsi que des centrifugations). Nous recueillons donc 5 fractions :
M (qui est en fait l'extrait "brut", du blanc d'œuf dilué dans du tampon à PH 10), F1, F2, F3 et E. E étant le le lysozyme purifié.

Il y a 2 questions qui me pose sérieusement problème.

La première : 1) Exprimer la concentration en protéines des différentes fractions.

Pour cela, j'ai pensé à faire un graphique, faire une droite et grâce à cette droite, je lis ensuite sur l'axe des abscisses (le truc "bateau"). Le problème c'est que je ne sais pas comment faire mon graphique.
Dans ce TP, nous faisons une gamme étalon de protéine standard.

Nous utilisons une solution de lysozyme à concentration de 0.5g/L
Et on prépare par la suite la gamme étalon comme ceci :

Solution de protéine standard (ml) NACL 0.9%(ml)
0 (0.015) 4
0,500 (0.157) 3.500
1.000 (0.306) 3.000
2.000 (0.600) 2.000
3.000 (0.915) 1.000
4.000 (1.176) 0

Nous passons ensuite cette gamme au spectro afin de calculer son absorbance (l'absorbance est le chiffre entre parenthèse).

Enfin, nous avons aussi l'absorbance de nos fractions :
M : 0.197
F1 : 0.199
F2 : 0.420
F3 : 0.641
E : 0.877

Je suis persuadé qu'il faut faire un graphique avec pour ordonné l'absorbance. Mais en abscisse il me faudrait une concentration. Or j'ai des ml ici. Et quand bien même si je le faisais avec des ml (et donc me donnerait en ml la valeur de mes fractions) ça me servirait pas à grand chose. Tout ce que je pourrai faire serait de multiplier cette valeur par 0.5g /L et obtenir des moles.
Bref, je suis perdu, je ne sais pas comment obtenir cette concentration ...

Je ne vais pas poser ma 2ème question car je m'aperçois que ça fait déjà un sacré pavé! En espérant que vous pouvez m'aider.
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[piwi]

Bonjour et bonne année à vous,

C'est pourtant assez simple (malgré le pavé qui est intimidant )
Vous avez réalisée une gamme de dilution de protéines standards (dont j'imagine que vous connaissiez la concentration stock; vous ne la précisez pas).
Cette gamme va vous permettre de réaliser une droite d'étalonnage qui va faire correspondre les concentrations de protéines aux D.O mesurées. Ce faisant, comme vous avez mesuré la D.O de vos échantillons de concentrations inconnues (vos fractions), il ne vous reste plus qu'à repporter les D.O sur votre droite d'étalonnage et lire la concentration qui y correspond.

Cordialement,
piwi

[invite4f2a033f]

Eh bien je coince sur mon axe des abscisses (là ou je devrais mettre mes concentrations de ma gamme étalon).

Car je n'ai pas ces concentrations.

J'ai fais mes 5 tubes de 4ml qui sont composés de ma solution de protéine standard à 0.5g/L et de Nacl à 0.9%. Or je ne connais pas sa concentration (peut-être est-ce 0.5 mol/L, c'est mal formulé donc j'émets une supposition).

Et je n'arrive pas à calculer la concentration de cette gamme étalon.
Je pense qu'il faut utilisé la concentration initiale qui est 0.5g/L.

Merci de l'aide en tout cas et bonne année à vous aussi

[piwi]

Et bien, quand vous avez:
4 ml sol + 0 ml NaCl ---> 0.5 g/l (0.5 mg/ml)
3 ml sol + 1 ml NaCl ---> 0.375 g/l (0.375 mg/ml)
2 ml sol + 2 ml NaCl ---> 0.25 g/l (0.25 mg/ml)
1 ml sol + 3 ml NaCl ---> 0.125 g/l (0.125 mg/ml)

C_i x V_i = C_f x V_f
i = initial et f = final
C_i = 0.5 g/l
V_f = 4 ml

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4f2a033f]

Ah en effet il fallait faire un produit en croix... Je comprend mieux et je me sens un peu bête de réaliser qu'il fallait faire ça. En tout cas, merci beaucoup de l'aide, je vais pouvoir avancer dans mon TP.

[invite4f2a033f]

Rebonjour,

Un dernier problème se pose face à ce fameux TP.
Je n'ai pas trouvé comment calculer une Activité spécifique. J'ai trouvé différentes formules... Et meme en les appliquant je ne peux pas les utiliser pour calculer l'enrichissement.

En effet, car l'enrichissement = AS2 / AS1
AS2 : Avant purification
AS1 : Après purification

L'enrichissement doit etre toujours supérieur à 1 puisque c'est un ratio. Mais avec certains des résultats que j'ai essayé avec mon AS, je trouve des ratios inférieur à 1. J'en déduis donc que la formule que j'utilise est fausse. A moins que mes données expérimentales soit erronées.

J'ai utilisé 2 formules : As = AC/ Masse totale des protéines
AS = AC/ Concentration des protéines

Quant à mon AC, je ne l'ai pas exprimé en UI mais en absorbance par minute puisque j'ai fais en fait l'équation de la pente de la courbe (delta y/delta x)

Une dernière chose, l'activité totale c'est bien : AC * volume ?