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Plasmide avec ou sans insert ?



  1. #1
    Kal-El

    Plasmide avec ou sans insert ?


    ------

    Bonsoir,

    Comment à partir d'une électrophorèse il est possible d'affirmer qu'un plasmide contient ou non un insert ?
    Dans mon gel j'ai 4 puits : A et B et A digéré et B digéré (par des enzymes de restriction, EcoRI).

    Dans les 4 puits sont visibles 4 bandes dont une grosse à chaque fois . Dans les puits des plasmides digérés, ces grosses bandes ont migré moins vite et sont donc plus en hauteur par rapport à celle visible dans les non digérés.

    Merci de votre aide !

    -----

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  3. #2
    Lopgor

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    Pus le fragment d'ADN est gros plus il est ralenti par le gel.

    Plus il est ralenti plus il s'arrête rapidement.

    Tes plasmides modifiés sont plus long que les plasmides originaux.

    Tes plasmides modifiés s'arrêtent avant les plasmides originaux.

  4. #3
    Kal-El

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    Merci de ta réponse !

    Ok, donc ça signifie que les deux plasmides que je possède (A et B) ont un insert car les deux modifiées s'arrêtent plus haut que les non-modifiés (en fait, ce sont que les bandes les plus épaisses qui s'arrênt plus haut, les 3 autres bandes sont plus ou moins identiques ou certaines plus bassent même).

    Je crois enfin que les bandes épaisses représentent les formes superenroulés de l'ADN (donc si c'est ça, en conclusion je peux dire que mes plasmides fragmentés contiennent un ADN superenroulés et que les 3 autres bandes sont des portions d'ADN plasmidique relâché ou linéaire, et que les deux possèdent un insert, A et B).

    C'est ça ?

  5. #4
    gorben

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    Salut,

    Sais tu ou se trouvent tes sites EcoRI? Combien en as tu? C'est la premiere question a te poser.

    Si c'est une manip il faut recommencer et deposer moins d'ADN (et changer de methode de digestion).
    Si c'est un exo il faut expliquer pourquoi tu ne peux rien conclure avec certitude...
    Desole mais conclure sur la presence d'insert avec ce genre de resultat c'est une erreur

    A+

  6. A voir en vidéo sur Futura
  7. #5
    Flyingbike
    Modérateur

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    mon avis est que sans les images et les cartes des plasmides on ne peut rien dire. On peut très bien avoir plusieurs inserts, rien du tout, des digestions partielles, etc...
    On peut très bien avoir 4 bandes sur un vecteur vide et 3 sur un vecteur avec insert.

  8. #6
    Kal-El

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    ben c'est un TP et à partir d'une simple électrophorèse faut dire si y'a présence de l'insert ou pas dans le plasmide.

    Merci de me remonter le moral en me disant que je peux pas conclure lol ^^

    je sais qu'on fait une digestion avec EcoRI et que EcoRI clive pour 3,1 kb.
    Donc comment à partir de ces seules données savoir si y'a un insert ou pas ?

    je sais que dans les puits où y'a les plasmides digéré, j'ai une bande en plus qui apparait, ça signifie qu'il y a un insert, non ?

    EDIT : je vous aurais bien posté une photo mais j'en ai qu'une de l'expérience, assez petit et pas de bonnes qualité, alors si je scanne ça, vous ne verrez rien du tout, désolé

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  10. #7
    gorben

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    Citation Envoyé par Kal-El Voir le message
    je sais qu'on fait une digestion avec EcoRI et que EcoRI clive pour 3,1 kb.
    Qu'est ce que ca veut dire?

    Citation Envoyé par Kal-El Voir le message
    Donc comment à partir de ces seules données savoir si y'a un insert ou pas ?
    Ben en l'etat des choses, tu ne peux pas. Il faut que tu ais une idee tres claire de ce que tu dois en theorie obtenir. Combien de sites de coupure EcoRI et quelle taille devraient etre les fragments attendus? Si tu as des bandes en plus ca peut etre :
    * plus de 1 insert
    * rearrangement bizarre du plasmide
    * plasmide non digere
    * etc

    Au pire tu expliques pourquoi tu ne peux conclure, et ce qu'il faudrait faire pour etre sur. C'est toujours mieux d'expliquer pourquoi la manip a pas marchee et de proposer comment y remedier plutot que de conclure sur une mauvaise manip et de se planter.

  11. #8
    Kal-El

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    ca veut dire que EcoRI clive et donne un fragment de 3,1 kb (j'ai compris ça, car c'est marqué en anglais).

    Ok, je vais donc mettre dans ma partie résultat/conclusion que je ne peux pas trop conclure (je mettrai sous forme d'hypothèse ce que je vous ai dit, puis dirai cela par la suite).
    Je pense que c'est la meilleurs chose à faire.

  12. #9
    gorben

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    le fragment de 3.1kb c'est en presence ou en absence d'insert?
    Obtient tu un fragment a 3.1 kb?

  13. #10
    Kal-El

    Re : Plasmide avec ou sans insert ?

    C'est bien le problème : je ne sais pas si j'obtiens un fragments à 3,1 kb. On est censé comparer avec le marqueur de poids moléculaire, mais on nous l'a donné sans plus d'informations, du coup, je me retrouve avec des bandes de partout et j'essaie de faire une conclusion avec ça.....

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