Transfert western blot raté

[ghotib]

Bonjour,

Je souhaite induire une protéine à partir d'un système procaryote (en E.coli) grâce à l'IPTG. J'ai donc fait des tests d'inductions sur des petits volumes de culture (5ml). J'ai lysé mes bactéries puis déposé la fraction totale sur gel SDS-PAGE. Après coloration j'ai pu déterminer que ma protéine d'intérêt était induite (taille estimée 74 kDa).

Le problème est que je souhaite confirmer que la bande présente sur mon gel est bien celle de ma protéine, donc je réalise un WB afin de localiser spécifiquement ma protéine d'intérêt. J'ai un gros soucis lors du transfert de ma protéine du gel vers la membrane PVDF...je vois les bandes de mes poids de marqueur moléculaire "coloré" qui sont de travers comme s'il y avait eu un transfert en diagonale, de plus les bandes semblent s'étaler et sortir de leur piste comme si elles avaient transférées de côté!
Et enfin, quand je fais un rouge ponceau pour voir le reste de mes protéines et ben je ne voit rien! Comment cela se fait-il?...

Info: gel SDS-PAGE invitrogen 10-12% bis-tis, migration à 200V-300mA- 1H15
Echantillon: lysat total de bactéries en tampon de laemli
Transfert: sur membrane PVDF réactivé à éthanol, 30V-300mA-1h30
Tampon de transfert: pour 1litre = glycine 14.25g, trizma HCl 3g, Ethanol 95% 200ml, le tout qsp 1litre H2O.

Bref, j'ai fait un transfert il y a 2 semaines avec un protéine purifiée...c'était magique: transfert impeccable, rouge ponceau OK et tout le reste aussi! Mais là je donne ma langue au chat, mon premier transfert était complètement de coté avec des bandes en zig-zag, on m'a dit qu'il devait y avoir une bulle qui a géné le transfert...alors je le refais avec du tampon de transfert tout neuf, je fais attention au bulle en roulant bien mon sandwich avec une pipette de 10ml...et résultat quasi identique: transfert moche.

Je tiens à préciser que le gel SDS-PAGE est quant à lui nickel avec des bandes bien droites et chacunes dans leurs puits.

Si quelqu'un à une explixation pour m'aider à comprendre pourquoi le transfert se fait-il de coté, je suis preneur!

Merci d'avance.
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[invite807a92f5]

Bonjour,

Tu as fait un transfert semi-sec je suppose, on doit pas normalement ne pas dépasser 25 V ?

Apres activation, tu as mis équilibrer ta membrane dans le tampon de transfert ? (Les tampons de transfert doivent être à 4°C)

As-tu équilibrer tes tampons (je vois du Trizema, qui a un pH acide) ?

Sinon a part je ne vois pas

[piwi]

Il y a une chose qui me choque dans votre solution de transfert. Vous mettez du Tris HCl alors qu'en général on met du Tris Base. Êtes vous certain de votre solution? A priori, on doit avoir un souci de pH.
Vous mettez peut être trop de protéines. Ca peut jouer. Mais puisque le gel est beau, j'ai un doute.
Sinon, la conductivité électrique methanol est meilleure que celle de l'ethanol. En général on préfère remplacer le methanol par de l'ethanol, mais pour les transferts, c'est pas forcément la meilleure idée. Ceci dit je ne pense pas que cela joue à ce point, et puisque vous avez déjà eu de bons résultats...
Puisque vous avez éliminé l'option "bulle" (qui de toute façon ne donne pas ça) et si vous êtes certain de ne pas vous planter dans votre solution de transfert, je ne vois plus qu'un problème technique avec la cuve ou un produit.

Cordialement,
piwi