Construction d'ADN

[Ladoudou31]

Bonjour à tous,

Je me tourne vers vous car cela fait maintenant deux mois que je suis sur une construction qui ne veut toujours pas marcher rrrrhhhhh !!!! Dire que cela devait être "un jeu d'enfant" selon les chefs.

Voici mon problème : je suis censé modifier une construction déjà existante, en changeant un insert par un autre. Cet insert se situe dans la protéine et non pas à son extrémité mais cela fonctionne. Il est entouré par deux sites BamHI.
J'ai dans un premier temps fait une PCR de l'insert choisi en y ajoutant les sites BamHI. Cette PCR fonctionne car je récupère des bandes de la bonne taille (et les primers ont servi pour d'autres constructions !!!). J'ai ensuite purifié mon produit PCR et lancer une digestion. En parallèle, j'ai lancé la digestion de mon futur vecteur. J'ai purifié mes produits de digestion et lancé la déphosphorylation de mon vecteur.

Jusque là aucun souci. J'ai ensuite purifié mon vecteur et fais migrer insert et vecteur pour faire la quantification de la ligation. Tout le monde est bien là, sans problème. Je me suis placé dans un rapport 1 vecteur pour 3 inserts. J'ai fais la ligation sur la nuit (T4 DNA ligase), transformé les bactéries de ligation et étalé sur boîte.

Le lendemain : RIEN. Même pas une petite colonie sur le témoin négatif du vecteur vide !!! J'ai également fais en sous clonant mon insert dans pGEMT mais là encore je récupère des bactéries blanches (qui sont censé avoir l'insert) mais au final après séquencage elles sont vides !!!!!

Je l'ai refait plusieurs fois et ça ne veut toujours pas marcher.

Est ce que quelqu'un peu m'aider car à cause de tous ça je suis en train de prendre un sacré retard sur ma thèse

Merci de votre aide

Une thésarde en détresse
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[piwi]

Votre temoin négatif vecteur vide, quel est il exactement? Vous transformez avec un vecteur vide (test de transformation) ou vous transformez avec le vecteur vide linéarisé (test de linéarisation)?

[Ladoudou31]

Merci de votre réponse.

Pour répondre à votre question, mon témoin négatif correspond à la même chose que la ligation, c'est à dire que mon vecteur a été digéré par BamHI pour enlever l'insert déjà présent, sauf que je ne mets pas d'insert (je mets de l'eau à la place). Je pense que ca doit donc être un témoin de linéarisation . Il permet de se rendre compte de la potentialité du vecteur à se refermer sur lui-même sans insert.

[piwi]

Ce que j'essaie de voir est si vous n'avez pas un problème avec votre ligase. L'enzyme vieillit mal et l'ATP encore plus. Avez vous essayé de changer vos stocks de réactifs?

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea069fc56]

Ton vecteur pGEM-T n'est pas déjà phosphorylé?
Normalement les vecteurs pGEM-T sont vendus déphosphorylés. Tu n'as donc pas besoin de les déphosphoryler. Vérifie la notice du vecteur.

Ca peut venir aussi de tes bactéires qui ne seraient plus compétentes...
Quel mode de transformation tu utilises? chimique ou électroporation?

[invite503f8c3e]

Quel type de bactéries ? pour que la transfo ca marche bien c'est mieux d'utiliser des bactéries commerciale.

[piwi]

Bof.......