Intégration de VIH-1 dans la chromatine: la chute d'un dogme.

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Démonstration in vitro et in silico que l'intégration de HIV-1 ne peut se faire dans une chromatine dense et stable et que la présence de nucléosomes peut être réfractaire à l'intégration.
On renverse ici, avec des manips plus précises et proche de la physiologie, le dogme admis il y a 15 ans.

PLoS Pathog. 2011 Feb 10;7(2) : http://www.plospathogens.org/article...C4C38C.ambra02

Functional coupling between HIV-1 integrase and the SWI/SNF chromatin remodeling complex for efficient in vitro integration into stable nucleosomes.

Lesbats P, Botbol Y, Chevereau G, Vaillant C, Calmels C, Arneodo A, Andreola ML, Lavigne M, Parissi V.

Laboratoire MCMP, UMR 5234 CNRS-Université Victor Segalen Bordeaux 2, Bordeaux, France.



Background

Lors d'une infection par VIH-1, une étape clé du cycle est l'intégration de l'ADN viral (qui vient d'être retro-transcrit) dans l'ADN de la cellule infectée. Cette étape est catalysée par l'intégrase virale.
A l'heure actuelle, le mécanisme d'intégration en tant que tel est bien connu, que ce soit in vivo ou in vitro, néanmoins il reste pas mal de zones d'ombres (rôles de certains co-facteurs de l'intégrase, implication de l'intégrase dans d'autres étapes du cycle viral).

Question

Parmi ces zones d'ombres nous nous sommes intéressés à l'impact de la chromatine sur l'intégration.
La chromatine outre son rôle dans la compaction de l'ADN cellulaire est importante dans la régulation de l'expression des gènes, ce en modulant l'accès de l'ADN à certaines protéines (Facteurs de transcription etc.), du coup les virologistes que nous sommes nous interrogeons si l'intégrase est elle aussi affectée par cette dynamique.

Comme je l'ai déjà dis, le dogme est que l'intégration rétrovirale est favorisée sur le nucléosome (unité de chromatine). Or ce dogme ce base sur des expériences obsolètes.

Dans ce papier, on revisite cette question in vitro par la mise au point d'un système d'intégration sur structure chromatinienne.

Méthode

Ce système fait intervenir un plasmide dans lequel on a cloné une séquence positionnant les nucléosomes afin de reproduire un polynucléosome après assemblage d'histones. Ce plasmide mime l'ADN cible cellulaire.
Une fois le système opérationnel, on a réalisé de l'intégration in vitro sur ce plasmide "chromatinisé" en présence d'intégrase pure recombinante et d'un "pseudo ADN viral".

Résultats

Avec ce système on montre l'inhibition de l'intégration par la présence de nucléosomes, en effet quand on "map" les sites d'intégration sur le plasmide le peu d'intégrants est hors de la séquence positionnant les nucléosomes.

On montre également que l'intégration dans ce système "chromatine" peut être restaurée après couplage de l'intégration avec le remodelage de la chromatine par le complexe SWI/SNF dont une sous unité est INI1 (hSNF5), INI1 (Integrase Interactor 1) 1er co-facteur cellulaire mis en évidence comme interagissant avec l'intégrase.
En plus de la restauration de l'intégration avec SWI/SNF après "mapping" des sites d'intégrations sur le plasmide, on s'est aperçu que cette fois ci la majorité des sites d'intégrations se trouve dans la zone positionnant les nucléosomes suggèrant un couplage fonctionnel entre l'intégrase et SWI/SNF via l'interaction avec INI1.

On appuie nos résultats in vitro par une analyse in silico de plus de 40 000 sites naturels d'intégration. Cette analyse est un algorithme de prédiction de positionnement de nucléosome en fonction de la séquence d'ADN, et on trouve que la moyenne des sites se trouve dans une région faiblement dense en nucléosome.

Conclusion

Pour conclure on montre ainsi que l'intégration de HIV-1 est réfractaire à la présence de nucléosomes denses et que par un couplage remodelage-intégration (SWI/SNF-IN) on lève cette inhibition.
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Merci Mantos de partager avec nous cette découverte.

Directement à chaud après avoir lu ton résumé, une question me vient à l'esprit : quelle réalité y a-t-il derrière l'interaction entre l'intégrase et SWI/SNF dans l'intégration in vivo du VIH puisque l'analyse in silico montre que le VIH privilégie des régions faiblement denses en nucléosomes pour s'intégrer?

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Merci Mantos de partager avec nous cette découverte.

Directement à chaud après avoir lu ton résumé, une question me vient à l'esprit : quelle réalité y a-t-il derrière l'interaction entre l'intégrase et SWI/SNF dans l'intégration in vivo du VIH puisque l'analyse in silico montre que le VIH privilégie des régions faiblement denses en nucléosomes pour s'intégrer?

C'est une très bonne remarque.

En fait, un aspect qu'il manque est qu'on développe est de savoir si oui ou non l'intégration se fait physiquement sur le nucléosome?
La notion qu'on apporte dans le papier est qu'une structure chromatinienne peut être permissive à l'intégration mais dans certaines conditions : à savoir le remodelage des histones.

Maintenant les résultats in silico indiquent une préférence pour des régions moins denses en nucléosomes mais pas nucléosomes free.
Ainsi même dans une région moins dense l'intégration VIH peut nécessiter un remodelage des histones présents et ce via SWI/SNF.
La situation in vivo est d'autant plus compliquée qu'il existe d'autres facteurs cellulaires intervenant dans le ciblage de certaines zones de la chromatine, donc effectivement, l'enjeu actuel est de compiler ces donnés et de compléter par des approches in vivo

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L'intégrase est-elle ciblée par les thérapies actuelles? C'est certainement trop précoce encore mais penses-tu qu'une stratégie thérapeutique ciblant ce mécanisme pourrait être envisageable?

[A voir en vidéo sur Futura]

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L'intégrase est-elle ciblée par les thérapies actuelles? C'est certainement trop précoce encore mais penses-tu qu'une stratégie thérapeutique ciblant ce mécanisme pourrait être envisageable?

Oui il existe des inhibiteurs d'intégrase : le raltégravir déjà disponible.
Un nouveau va être distribué si je ne m'abuse : elvitegravir

Sinon le mécanisme mis en évidence dans le papier peut bien sur constituer une cible thérapeutique par des approches d'inhibition d'interaction (synthèses de peptides "disruptant" l'interaction).
On peut également voir ce système comme un outil en thérapie génique, modifier le partenaire cellulaire pour cibler certaines régions de la chromatine afin de sécuriser l'intégration de transgènes.

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D'accord donc l'intégrase est une bonne cible.

Le VIH est un mauvais copieur et c'est un obstacle de taille en thérapie puisque des résistances peuvent émerger rapidement. Je suppose donc que les étapes où le VIH a besoin d'interagir physiquement avec l'hôte au cours de son cycle sont de bonnes stratégies thérapeutiques. En effet, même si le virus peut muter tant qu'il veut tant que ses différentes fonctions sont préservées, il ne peut pas muter les zones d'interactions avec l'hôte sous peine de ne plus pouvoir interagir avec les protéines concernées (vaste hypothèse à confirmer ou infirmer).
La stratégie de peptide compétiteur dont tu as parlé me semble donc tout à fait pertinente. Reste à savoir dans quelle proportion cela affecte réellement le VIH in vivo.

Autre chose, avez-vous réalisé une étude de modélisation moléculaire afin de visualiser le site d'interaction putatif entre l'intégrase et INI1? Si c'est le cas, cette interaction masque-t-elle un site nécessaire à la fonction de l'intégrase? Pour aller au bout de mon idée, je me dis que si cette interaction perturbe la fonction de l'intégrase, un peptide compétiteur d'INI1 pourrait agir en même temps comme inhibiteur de l'intégrase...

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Je suppose donc que les étapes où le VIH a besoin d'interagir physiquement avec l'hôte au cours de son cycle sont de bonnes stratégies thérapeutiques. En effet, même si le virus peut muter tant qu'il veut tant que ses différentes fonctions sont préservées, il ne peut pas muter les zones d'interactions avec l'hôte sous peine de ne plus pouvoir interagir avec les protéines concernées (vaste hypothèse à confirmer ou infirmer).
La stratégie de peptide compétiteur dont tu as parlé me semble donc tout à fait pertinente. Reste à savoir dans quelle proportion cela affecte réellement le VIH in vivo.

C'est un des avantages lorsqu'on cible autre chose qu'une activité d'une protéine virale.

Autre chose, avez-vous réalisé une étude de modélisation moléculaire afin de visualiser le site d'interaction putatif entre l'intégrase et INI1? Si c'est le cas, cette interaction masque-t-elle un site nécessaire à la fonction de l'intégrase? Pour aller au bout de mon idée, je me dis que si cette interaction perturbe la fonction de l'intégrase, un peptide compétiteur d'INI1 pourrait agir en même temps comme inhibiteur de l'intégrase...

Pour ce qui est des modélisation, c'est assez juvénile car on vient juste d'avoir une structure d'une forme active entière d'intégrase (pas de VIH en plus) retrovirale. L'intégrase VIH est un casse tête pour les structuralistes/cristallographes.

Du coup ces études se développent juste.

Sinon hors contexte cristallographique la zone d'interaction INI1 - IN est connue et cette zone ne semble pas trop sensible pour l'activité d'intégrase.

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J'ai une autre question, cette fois-ci relative au fonctionnement du complexe SWI/SNF.

Comment est contrôlée l'activité de ce complexe? On a l'impression que l'intégrase recrute un complexe actif en permanence qui va exciser les nucléosomes à proximité du VIH. Cependant, toutes les activités biologiques étant contrôlées (surtout SWI/SNF qui pourrait être responsable d'une instabilité génétique sans contrôle), je suppose que des mécanismes de contrôle existent pour SWI/SNF. Dans ce cas, comment cela se passe-t-il dans le cas que tu montres ici, si vous l'avez envisagé?

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J'ai une autre question, cette fois-ci relative au fonctionnement du complexe SWI/SNF.

Comment est contrôlée l'activité de ce complexe? On a l'impression que l'intégrase recrute un complexe actif en permanence qui va exciser les nucléosomes à proximité du VIH. Cependant, toutes les activités biologiques étant contrôlées (surtout SWI/SNF qui pourrait être responsable d'une instabilité génétique sans contrôle), je suppose que des mécanismes de contrôle existent pour SWI/SNF. Dans ce cas, comment cela se passe-t-il dans le cas que tu montres ici, si vous l'avez envisagé?

Pour ce qui est du fonctionnement de SWI/SNF, son activité est ATP dépendante. Le mécanisme exact de remodelage de la chromatine in vitro et in vivo est pas encore super bien élucidé (1:sliding : le remodeleur fait glisser l'ADN sur le nucléosome en formant une sorte de boucle extrudée ou 2: de l'éviction de nucléosome). Ce qui est connu c'est qu'effectivement son activité est régulé in vivo surtout au niveau du recrutement du remodeleur sur les sites à remodeler. Ce sont généralement les modifications d'histones (acétylation/méthylation) qui recrutent certaines protéines qui elles même vont recruter le remodeleur.

Nous in vitro l'activité on la contrôle par un test simple d'accessibilité aux enzymes de restriction. Le phénotype qu'on observe est dépendant de l'activité de SWI/SNF (on le voit pas en absence d'ATP, ni avec d'autres complexes de remodelage).

Maintenant si on regarde in vivo pour le cas du HIV-1, les études de séquençage massif de loci d'intégration montre que HIV-1 favorise l'intégration dans des régions moins dense en nucléosome (notre étude) mais surtout (pour faire le lien avec SWI/SNF) dans des régions où les histones ont ces fameuses modification post-traductionnelles associées à la transcription (et à un remodelage).

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Maintenant si on regarde in vivo pour le cas du HIV-1, les études de séquençage massif de loci d'intégration montre que HIV-1 favorise l'intégration dans des régions moins dense en nucléosome (notre étude) mais surtout (pour faire le lien avec SWI/SNF) dans des régions où les histones ont ces fameuses modification post-traductionnelles associées à la transcription (et à un remodelage).

Cette partie de ta réponse me plait particulièrement! En effet, j'imaginais mal le complexe SWI/SNF se faisant recruter par l'intégrase puis exercer son activité partout sans spécificité particulière. Cela amène une autre question : l'intégration du VIH se fait au niveau de zone faiblement denses en nucléosomes (donc plutôt euchromatine, gènes exprimés) du fait d'une accessibilité de l'ADN favorisée, du fait de marques épigénétiques permettant l'activation de SWI/SNF spécifiquement à ce niveau (l'hétérochromatine étant peu dynamique donc peu de recrutement/activation de SWI/SNF), du fait qu'une intégration du VIH dans une zone active du point de vue de l'expression génique favorise probablement l'expression de ses propres gènes une fois intégré, ou un peu de ces trois hypothèses? Pour la première hypothèse tu en as déjà parlé, c'est juste pour la confronter aux autres.

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Je pense que les 2 premières hypothèses sont globalement identique et sont la résultante d'un environnement chromatinien de zone de transcription qui semble favorable pour l'intégration de HIV-1. Effectivement on peut aussi ajouter ta 3eme hypothèse pour la transcription du provirus.

Maintenant la situation in vivo demande a être bien décrite car d'autres co-facteur de l'intégrase existent, notamment une protéine super importante : le facteur de transcription LEDGF/p75 qui bind l'intégrase est qui est responsable de son ciblage vers les zones de transcription. Du coup on peut facilement imaginer que ce p75 drive l'intégrase dans ces zones de transcription active et que localement on a un recrutement de SWI/SNF pour permettre l'intégration dans cette région moins dense en nucléosomes et ayant les modifs épigénétiques particulières.

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Ce facteur de transcription LEDGF/p75 est-il de l'hôte ou du virus? D'après ce que tu ajoutes, on pourrait imaginer un complexe d'intégration où l'intégrase occupe une position centrale et les autres co-facteurs l'aident à remplir sa fonction. Les machineries épigénétiques fonctionnent beaucoup sous forme de complexes au sein desquels on a une protéine reconnaissant un motif épigénétique particulier, une autre protéine catalysant une modification, des co-facteurs, bref de vrais machines moléculaires opérant de manière précise, efficace et hyper-régulée. L'hypothèse est assez éloignée de cette étude mais les complexes moléculaires sont assez élégant en biologie et expliquent l'efficacité de certains mécanismes. L'intégration des virus comme HIV étant réputée très efficace, cela me parait envisageable (même si beaucoup de mécanismes sont très efficaces sans nécessiter la formation de complexes).

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Ce facteur de transcription LEDGF/p75 est-il de l'hôte ou du virus? D'après ce que tu ajoutes, on pourrait imaginer un complexe d'intégration où l'intégrase occupe une position centrale et les autres co-facteurs l'aident à remplir sa fonction. Les machineries épigénétiques fonctionnent beaucoup sous forme de complexes au sein desquels on a une protéine reconnaissant un motif épigénétique particulier, une autre protéine catalysant une modification, des co-facteurs, bref de vrais machines moléculaires opérant de manière précise, efficace et hyper-régulée. L'hypothèse est assez éloignée de cette étude mais les complexes moléculaires sont assez élégant en biologie et expliquent l'efficacité de certains mécanismes. L'intégration des virus comme HIV étant réputée très efficace, cela me parait envisageable (même si beaucoup de mécanismes sont très efficaces sans nécessiter la formation de complexes).

L'intégrase et l'ADN viral ne sont pas nus dans la cellule. C'est un complexe nucléo-protéique qui trafique dans la cellule, complexe appelé Complexe de Pré-Intégration (CPI).
Ce CPI contient plusieurs protéines, des virales : IN ; RT ; Nc ; Vpr ; MA et aussi des protéines cellulaires : BAF ; INI1 ; LEDGF/p75.

L'infection de HIV est super régulée, le CPI joue des rôles dans le transport, import et intégration. L'intégration elle aussi est super régulée et c'est sous cette forme de CPI qu'elle a lieu.

L'image d'une intégrase seule avec l'ADN viral est fausse.

Donc oui il y a un complexe d'intégration et oui on peut imaginer que ce complexe d'intégration interagisse à un moment donné avec un complexe de remodelage (SWI/SNF via INI1 ?)

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Ok merci pour cette réponse. Mes questions sont totalement naïves n'ayant aucune connaissance bibliographique sur le VIH (à part que c'est un rétrovirus qui infecte certaines cellules du système immunitaire ).