Dosage du glycogène hépatique par la soude?:shock:

[invitecbbcb20d]

Bonjour,
Lors d'un TP sur la régulation du métabolisme glucidique chez le rat j'ai été amené effectuer un protocole que je vais vous décrire entierement pour que vous puissiez m'aider, je ne comprend pas l'utilité du dosage par la soude que j'ai du effectuer a la fin.

Voici le protocole : prélever un lobe foie rat, le broyer en présence de sable et d'acide, puis centrifuger ce broyat pendant 5 minutes.

J'ai ensuite récupérer le surnageant et me suis débarrassé du culot qui contenait les protéines.

Puis j'ai ajouter 2 volumes d'alcool a 95% à un volume de surnageant, j'ai agiter le mélange pour faire précipiter le glycogène.

Ensuite une nouvelle étape de centrifugation, puis on élimine le surnageant et on récupère le glycogène qui forme un culot blanchâtre.

Ensuite il a fallu dissoudre le glycogène avec de l'eau distillée puis purifier la solution de glycogène en faisant précipiter ce dernier en présence de 1 ml d'éthanol a 95%, puis centrifuger.

On récupère ensuite le précipiter et on ajoute 2 ml d'acide sulfurique a 2,5N puis on chauffe dans un bain marie a 100°C pendant 30 minutes, cette étape permet l'hydrolyse du glycogène en glucose.

Enfin on refroidit le tube et on ajoute 1 goutte de phénol phtaléine puis on ajoute délicatement une solution de soude a 2,5N jusqu’à obtenir la couleur rose-rouge, et noter le volume de soude versé.

J'ai beau retourner le problème dans tous les sens je ne vois pas l'utilité de ce "dosage" du glucose par la soude. Je ne pense pas que du glucose puisse être doser par la soude, si vous pouviez m'indiquer l'intérêt de cette étape je vous en serai trés reconnaissant.

Merci d'avance
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[invite75e918c6]

C'est une réaction acido-basique indirect.
Tu as rajouter de l'acide où l'excès sera normalement neutralisé par la soude

Je dis bien l'excès car tu as une partie qui a servi à hydrolyser le glycogène donc

n (HCl)total = n (HCl) ayant réagi avec le glycogène + n (HCl) restant

[invitecbbcb20d]

Merci pour la réponse, donc tu penses que c'est pour neutraliser l'acide sulfurique que j'ai mis préalablement a la mise de mon tube dans le bain marie pour hydrolyser le glycogène en glucose?

Ce qui m'étonne c'est que dans le tp il semblait important de noter le volume de soude que l'on a ajouté. Mais si c'était juste pour neutraliser l'acide sulfurique, le volume de soude ajouter ne nous sert a rien...

[invitea74316c7]

Alors le phénol phtaléine est un indicateur de pH. L'ajout de NaOh dans ton mix va transformer sauf errer l'acide gluconique en gluconate qui va se traduire au niveau de la couloeur de ton réactif par un passage du jaune au brun. Ainsi tu peux quantifier ta concentration de glucose.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitecbbcb20d]

La couleur est passer au rose-rouge, mais justement par la suite du tp on rajoute quelques gouttes d'acides sulfurique afin de revenir a une solution incolore puisque par la suite on effectuera un dosage enzymatique du glucose puis on utilisera un photomètre.

Je suis toujours étonné d'avoir fait un dosage par la soude, juste pour neutraliser l'acide sulfurique préalablement mis. Et reste persuadé que l'on ne nous a pas fait noter le volume de soude ajouter inutilement.

[Flyingbike]

oui il me semble bien que l'on ne peut pas du tout doser le glycogène simplement de cette façon. Il faut effectivement hydrolyser en glucose. Ensuite on dose le glucose indirectement en mesurant la production de NADH a partir de NAD+ dans la réaction enzymatique catalysée par la glucose-6-phosphate deshydrogénase (il faudra donc une kinase pour phosphoryler le glucose issu de l'hydrolyse du glycogène)

[invite75e918c6]

Quand je dis neutralisé, c'est atteindre l'équivalence. L'ajout d'un indicateur de pH te permet de visualisé cette équivalence. Pour moi, tu doses le produit acide libéré lors de l'ajout du HCl (désolé, j'ai parlé d'excès mais je ne pense pas qu'a cette concentration, on peut dire un excès d'HCl) et donc il faut que tu le dose.

Tu ne peux pas doser directement le glucose en rajoutant une quelconque molécule. Il faut que tu le "transforme" en entité acide ou basique qu'il puisse être dosable par du HCl ou NaOH pour pouvoir faire un dosage acido-basique
(je ne sais pas si j'ai été assez clair)

[invite75e918c6]

oui il me semble bien que l'on ne peut pas du tout doser le glycogène simplement de cette façon. Il faut effectivement hydrolyser en glucose. Ensuite on dose le glucose indirectement en mesurant la production de NADH a partir de NAD+ dans la réaction enzymatique catalysée par la glucose-6-phosphate deshydrogénase (il faudra donc une kinase pour phosphoryler le glucose issu de l'hydrolyse du glycogène)

Ce n'est pas une cinétique enzymatique qui est fait dans son protocole. Aucune enzyme a été rajoutée.

[invitecbbcb20d]

ah d'accord, je pense comprendre, et quand tu parles de HCL, dans mon cas c'est de l'acide sulfurique que j'ai ajouté dont on parle c'est bien ça?

[invitecbbcb20d]

Ah non, j'avais mal lu, donc la soude me permet de transformer le glucose en entité basique?
J'ai toujours du mal a comprendre a quoi me sert cette étape étant donné que je fais ensuite un dosage enzymatique du glucose puis j'utilise un photométre pour connaitre la concentration de glucose.

[invite75e918c6]

Oui, dans ton cas c'est H2S04 l'acide donc attention quand tu vas calculer la concentration en glucose. Pour l'instant, admets qu'une mole d'acide va transformer ton glucose en acide gluconique qui lui sera dosable avec le NaOH. (je dis admets car je ne suis pas convaincu de ma réponse)
Tu as 2 réactions qui se fait

Glucose + H2SO4 => acide gluconique
Acide gluconique + NaOH => gluconate (surement mais peu importe, un composé basique)

Quand tu vas doser, à l'équivalence, tu vas dire que

n NaOH = n acide gluconique
et que n acide gluconique = n H2S04
tu sais que n acide gluconique = n glucose

Au final, tu sais que n NaOH = n glucose
(tu utilise les formul n = C*V des 2 cotés pour trouver la concentration en glucose)
Mais fait attention, je pense qu'il y a un coeffiscient stockiométrique à mettre dù à H2SO4 mais je me penche pas trop sur le problème pour le moment


En faite, avec ton dernier post, tu fais : un dosage acidobasique, un dosage enzymatique et un dosage par photomètre pour le glucose. A mon avis, on va te demander de comparer ces techniques et de dire laquelle est la meilleur.

[invitecbbcb20d]

Merci beaucoup, c'est plus clair ainsi.

[Flyingbike]

Oui, dans ton cas c'est H2S04 l'acide donc attention quand tu vas calculer la concentration en glucose. Pour l'instant, admets qu'une mole d'acide va transformer ton glucose en acide gluconique qui lui sera dosable avec le NaOH. (je dis admets car je ne suis pas convaincu de ma réponse)
Tu as 2 réactions qui se fait

Glucose + H2SO4 => acide gluconique
Acide gluconique + NaOH => gluconate (surement mais peu importe, un composé basique)

Quand tu vas doser, à l'équivalence, tu vas dire que

n NaOH = n acide gluconique
et que n acide gluconique = n H2S04
tu sais que n acide gluconique = n glucose

Au final, tu sais que n NaOH = n glucose
(tu utilise les formul n = C*V des 2 cotés pour trouver la concentration en glucose)
Mais fait attention, je pense qu'il y a un coeffiscient stockiométrique à mettre dù à H2SO4 mais je me penche pas trop sur le problème pour le moment


En faite, avec ton dernier post, tu fais : un dosage acidobasique, un dosage enzymatique et un dosage par photomètre pour le glucose. A mon avis, on va te demander de comparer ces techniques et de dire laquelle est la meilleur.

nan nan, il a bien dit que par la suite il effectuerai un dosage enzymatique. On ne peut pas doser le glycogène aussi simplement. Ici il s'agit sd'une hydrolyse acide puis neutralisation. Le dosage en lui même aura lieu plus tard

[invitecbbcb20d]

Je suis a nouveau perdu avec ce dernier post.
Qu'en est'il au final?
La soude que j'ajoute sert a neutraliser l'acide sulfurique ou a faire un dosage comme l'a indiquer Vicrocrotte?

[Flyingbike]

c'est toi qui fais le TP donc dis nous si il y a bien un dosage enzymatique derrière.
Pour ma part je pense que c'est impossible de doser le glucose de la façon de Vilcrocrotte (on ferait comme ça sinon au labo).

[invitecbbcb20d]

oui, il y a bien un dosage enzymatique derrière puis on utilise le photomètre.
Donc l'ajout de soude ne servirait qu'a neutraliser l'acide sulfurique utiliser pour l'hydrolyse du glycogene en glucose?

[Flyingbike]

Oui, car la réaction enzymatique nécessite un pH contrôlé (l'enzyme est fragile)

[invitecbbcb20d]

Merci, j'avais aussi pensé a ça au départ.
Le doute étant venu du fait que dans le tp je dois bien noter le volume de soude ajouter, et donc je chercher du coté d'un dosage du glucose par la soude pour utiliser le volume.
Je vais donc en rester là en disant que c'est pour neutraliser l'acide sulfurique et me contenter d'un calcul de la concentration de glucose par réaction enzymatique et photomètre.

[invite75e918c6]

D'accord, désolé pour cette confusion alors.

Je pensais que c'était des méthodes totalement indépendantes. Donc dans ce cas là, oui c'était bien de la neutralisation d'acide.
Vraiment désolé de vous induire en erreur.