cytométrie en flux
Bonjour, je me pose certaines questions sur la cytométrie :
Lors d’une mesure en cytométrie en phase liquide (cytométrie en flux), comme différencie-t-on les faux positifs (particules auto-fluorescentes) des vraies bactéries?
Qu'est ce que la notion de Ct, comment la calcule t-on?
Je cherche deux types de sondes fluorescentes utilisées pour la PCR en temps réel.
Comment peut-on vérifier l'absence d'inhibiteur de PCR lors d'une PCR en temps réel?
Pouvez vous m'aidez svp?
1) on peut exclure des particules selon leur taille et l'intensité (paramètres a définir)
2) le Ct en PCRq ? c'est le nombre de cycles d'amplification nécessaires pour que la fluorescence atteigne un seuil prédéfini. Le Ct est lié a la concentration de départ de la matrice.
3) il y a par exemple le sybrGreen pour la PCRq classique, FAM, TET pour la PCR de type Taqman
4) il faut mesurer l'efficacité d'amplification. Pour cela on réalise une gamme de dilutions d'un standard, et on vérifie que la concentration calculée a partir du CT est proche de la concentration théorique, ce qui signifie qu'on est proche d'une efficacité de 100%.
que détecte une sonde couplée au fluorophore HEX, quel est son role svp?
Le sybr Green n'est pas à proprement parler une sonde. Pour les sondes, tu as les Taqman, Scorpion ou Beacon par exemple. Il y en a surement d'autres, ça fait longtemps que je ne me suis pas renseigné. Pour plus d'infos, le net est ton ami
Pour l'inhibition, on peut maintenant mettre un contrôle positif interne dans les puits, avec une sonde spécifique. Si ni l'échantillon ni le contrôle ne sont amplifiés, on sait qu'il y a des inhibiteurs.
par exemple j'ai un CT=32 pour une détection de Salmonella et un CT=25 pour une sonde HEX comment puis je interpréter ce résultat?
est-il possible de calculer le ct manuellement?
merci
