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Problème bande inconnue PCR



  1. #1
    clant

    Problème bande inconnue PCR

    Bonjour a tous,

    J'ai un problème, j'ai fais mes extractions d'ADN de sol, j'ai concentrer mon ADN (car sol pauvre..) et quantifier au nanodrop. Je tombe sur des quantités suffisantes (environ 20 à 50 ng/uL) donc ok pour la PCR.

    Je fais ma PCR, je quantifie ensuite pour voir si l'ADN à bien été amplifier (environ 400ng/uL) donc ok pour l'amplification.

    Seul problème, lorsque j'ai fais le contrôle PCR sur gel agarose 1,5%, je trouve bien la bande attendue de l'amplicon à 230 pb, mais je trouve aussi une bande à environ 500-600pb. Je pensais à un smear, mais la bande est plutôt nette (c'est pas une trainé), et beaucoup moins dense que celle de l'amplicon.

    Je pensais alors a une hybridation aspécifique, mais ce qui parrait étonnant, c'est que cette bande non voulue est présente dans TOUS les échantillons traités lors de la PCR (environ une vingtaine).

    Je rappel que les amorces utilisées sont celles de l'ARN ribosomal 16S.

    Merci par avance, je dois finir mon rapport de stage, et ce coin d'ombre me bloque! (la DGGE a bien fonctionner par la suite).

    Cordialement.

    Ci joint la photo de mon gel

    -----

    Images attachées Images attachées

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  3. #2
    Guillaume69

    Re : Problème bande inconnue PCR

    Bonjour,

    Il me semble que les réarrangement génomiques de l'ADN codant pour les ARNr est fréquent, avec notamment des duplications.

    Ca pourrait pas être ça ?
    Une forme majoritaire courte, et une forme minoritaire dupliquée, ou réarrangée.
    Je dirai même plusieurs formes minoritaires, car pour moi tu as plusieurs bandes (je dirais 3 vue la photo), d'intensité d'autant plus faible que le poids moléculaire est élevé.

    Tu peux pas extraire sur gel et envoyer à séquencer ? Tu seras fixé.
    Dernière modification par Guillaume69 ; 14/07/2011 à 07h18.

  4. #3
    Yoyo

    Re : Problème bande inconnue PCR

    salut

    J'aurai tendance a penser a un concatemere. Il est possible que ta bande corresponde à un multiple de ta bande unique. Les gènes d'ARNr etant souvent en tandem tu as pu en amplifier 2 copies au lieu d'une seule.
    Les bandes de faibles intensités sont toujours plus efficacement amplifiée.

    YOyo

  5. #4
    Guillaume69

    Re : Problème bande inconnue PCR

    C'est à peu près ce que je pensais aussi, non ?

  6. #5
    clant

    Re : Problème bande inconnue PCR

    Merci pour vos réponses, et non malheureusement je ne peut pas découper et envoyer à séquencer, mon stage étant terminé, je n'ai pu envoyer à séquencer seulement mes bandes de DGGE.

    Concernant ces bandes de poids moléculaire élevé correspondant pas à l'amplicon, je pensais à une hybridation aspécifique, car les amorces 518r et 338f sont spécifique d'une séquenc de l'ARNr 16s qui est présentent chez toutes les bactéries, mais peut-être qu'une autre séquence présente des analogie avec cette séquence, et cela expliquerais la faible intensité (car séquence moins spécifique de celle ciblé)

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Yoyo

    Re : Problème bande inconnue PCR

    Salut

    A mon avis la moindre intensité viens tout simplement du fait que la bande a amplifier est plus grande, donc moins efficacement amplifiée.

    YOyo

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