Ma protéine se dégrade avec le temps dans les culots à -20°C, car je n'arrive plus à la purifier ?

[invite62f842e0]

Bonjour,
Je suis en thèse et je rencontre des problèmes avec ma protéine, je travaille sur actin like et je fais des cultures dans des fermenteurs pour avoir des meilleurs rendements...
Mon dernier fermenteur date de 5 mois à peu près, j'ai stocké mes cellules bactériennes dans des falcons à -20°C et à chaque fois je sors un falcon pour faire ma purif... au départ ça allait, mais depuis hier je ne retrouve plus ma protéine au moment de l'élution (sachant que ma protéine est taggée et je la purifie sur une colone d'affinité Nickel) alors ma question est: est ce que au cours du temps la protéine se dégrade à -20°C, est ce qu'elle vieilli mal? comment ça se passe?

Merci de m'aider
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[invitef5962f47]

Tu resuspends tes culots dans le tampon de lyse avant de les mettre a - 20 C ? J'ai souvenir que c'est préférable de resuspendre dans le tampon de lyse et de congeler a - 80 C pour conserver les culots sur le long terme.

Dans mon labo, les culots (resuspendus ou non) sont toujours mis a - 80 même si on l'utilise le jour d'après et il n'y a jamais eu de problème (par contre on ne les a jamais conservé 5 mois).

[invite2e21fee6]

Les protéases peuvent être toujours actives à -20°C. Si tu congèle un lysat cellulaire ou des cellules, tu conserve ta protéine en contact avec des protéases.

Après production, le mieux est d'effectuer quelques étapes de purification et d'éliminer le milieu de culture et les débris bactériens, si tu le peux.

[invite62f842e0]

En fait j'ai une protéine ultra compliquée, comme je vous ai dis c'est une actin like assez spéciale qui polymérise en un cart de tour donc il me faut tout le temps du stock pour la purifié souvent...
quand je fais le fermenteur je centrifuge le tout et je sépare le culot dans des petits falcons que je stocke à -20°C... donc il se peut que les protéases m'ont fait un sale tour...
en discutant un peu au labo on m'a suggéré aussi de traiter les culots avec de l'azote liquide et de mettre le tout à -80°c...
Ceci dit, je viens d'avoir 0.64 mg/ml de protéine pour un équivalent de 2.5/3 L (oui c'est très peu), je me suis lancé dans une gel filtration et je vais voir si j'ai réussi à sortir au moins quelques microgrammes de protéines...

[A voir en vidéo sur Futura]