Protocole ELISA

[inviteac556966]

Bonjour,

Je suis chargée d'imaginer un protocole visant à déterminer la réaction immunitaire d'un poisson (D. labrax) face à une infection de parasites branchiaux (D. aequans). J'ai pensé réaliser en premier un test ELISA pour savoir si le poisson exprime des anticorps anti-parasite dans son sang. Pensez vous que le protocole suivant soit cohérent??


"La détection des anticorps se fait par test ELISA. Le sang des poissons est récupéré par la veine caudale et mis à coaguler une nuit à 4°C. Le sérum est ensuite récupéré et dilué. Les antigènes proviennent des parasites. L’anticorps de détection est une immunoglobuline anti-loup obtenue en injectant des antigènes de loup dans un lapin. De la même façon, l’anticorps secondaire est une immunoglobine anti-lapin obtenue en injectant des antigènes de lapin dans une chèvre (anticorps disponibles dans le commerce). Cet anticorps secondaire est couplé à une enzyme peroxydase obtenue chez le radis ou le raifort.

Les puits sont ensuite rincés : si l’anticorps secondaire n’est pas fixé, il sera éliminé. On ajoute ensuite de l’eau oxygénée, substrat de l’enzyme. Si l’enzyme est présente, l’eau oxygénée sera transformée en deux molécules d’eau et la couleur de la solution sera modifiée. Le dosage se fait par spectrophotométrie."

Merci
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[inviteb6144ea4]

Bonjour,

pour affiner votre protocole, pensez à réaliser une étape de blocage après la fixation de votre antigène au fond du puits.
Les puits sont rincés après chaque incubation d'anticorps.
Pensez également à arrêter la réaction enzymatique avec l'ajout d'une solution acide. (changement de couleur jaune -> bleue en général)

NB: je ne suis pas expert dans le domaine mais pourquoi avoir choisi trois anticorps? Ne pouvait-on pas couplé la peroxydase à l'anticorps anti-loup directement?

[inviteac556966]

D'accord merci pour vos précisions.
Pensez vous qu'on puisse réellement faire un dosage colorimétrique avec l'enzyme peroxydase et de l'eau oxygénée en substrat?
J'ai mis 3 anticorps car j'ai repris ce protocole d'un article scientifique mais ils ne précisent pas pourquoi 3 et pas 2 (mais je suppose qu'il y a bien une raison...)

[Flyingbike]

H2O2 + HRP a mon avis ça ne donne pas grand chose. Le substrat quantifiable de la peroxydase est plus complexe que ça.

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteac556966]

Du coup quel substrat serait il plus judicieux d'apporter à la peroxydase pour pouvoir faire un dosage colorimétrique?

[Flyingbike]

en fait l'h2O2 est nécessaire pour que la peroxydase oxyde un autre composé, qu'on choisit pour qu'il produise une couleur facilement détectable.

Le plus utilisé en elisa : type TMB (http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=01041009)