Problème sélection kanamycine

[invitea74316c7]

Bonjour à tous,

Je vous écris car j'ai un problème que je n'arrive pas a résoudre:

J'essaie de sous cloner un gène dans le vecteur pADTRACK-CMV, donc un plasmide avec deux ORF, mais surtout une résistance à la kanamycine. Malheureusement jusqu'à maintenant j'obtiens toujours des tapis complet de colonie absolument partout et surtout même dans mes controles ne contenant que des bactéries (non transformées!). J'ai tester mes deux types de bactéries, à savoir des DH5alpha et des HB101. J'utilise du LB agar avec 50ug/ml de kanamycine et j'ai déja changé 3 fois d'antibiotique, j'ai changé tous les produits utilisé mais rien n'y fait, j'obtiens toujours un tapis de bactérie!

Auriez vous une solution?

Les HB101 je précise ne poussent pas sous forme de tapis, elle semblent plus sensible à la kanamycine que les DH5alpha, mais est ce que ces bactéries sont de bonnes bactéries????
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[invitea74316c7]

Alors même avec 100ug/ml mes dh5alpha arrivent à pousser. Elles ont probablement du acquérir une résistance à la kanamycine! Je ne vois aucune autre explication!

[invitec9f0f895]

Salut

C'est très étrange car la kanamycine est bactéricide donc très efficace!
Soit ton antibio est dégradé (ajouté a trop forte temperature?), soit ta souche est devenue résistante en effet.

YOyo

[invite853321bf]

Si tu as un tapis, je serai assez tenté de parier sur une contamination.
Sinon l'hypothèse de yoyo sur la t° est aussi a fortement envisagé.
Ça parait étrange quand même que toutes tes bactéries soient devenues résistantes. A moins que tu les fasses tout le temps pousser sur des milieux enrichis en kanamycine, c'est le genre de mutation qui a tendance à disparaitre, étant plutôt contre productive pour la bactérie. La souche non résistante aurait du supplanter la résistante sur milieu non enrichi.
Tu n'as pas un tube mère au surgélateur que tu n'utilises pas ?
Nous faisons ça dans mon labo pour les souches type, pour pouvoir repartir d'une souche "propre" en cas de problème avec la solution de travail.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea74316c7]

J'ai déja envisagé la température et j'ai donc testé à la température minimum possible, j'ai testé 3 antibio différent, j'ai également testé mon milieu SOC uniquement sur les boites et cela vient vraiment des bactéries elles mêmes! J'ai testé des HB101 qui elle semblent ne pas être résistantes. Je vais donc continuer avec ces bactéries.