PCR, template et riz anti-alzheimer

[invite994c90d6]

Bonjour à tous,

Je débute un peu en biologie moléculaire et j'ai quelques difficultés pour comprendre une publication.

Si ça intéresse des gens, voici la référence:
"Transgenic Rice expressing Amiloid beta-peptide for Oral Immunization", T.Yoshida, E.Kimura, S.Koike, International Journal of Biological Sciences, 7(3):301-307, 2011

L'objectif est de récupérer/amplifier le gene codant pour les plaques AB (amyloïdes, responsables de la maladie d’Alzheimer) fusionné au gène de la GFP, pour essayer de l'insérer dans le riz.

Globalement la procédure qui me pose problème est la suivante:
- on se sert du gene codant pour APP656 comme template. Les plaques AB étant issues de la découpe de cette protéine, on peut donc considérer que le gène codant pour AB se trouve quelque part dans le gene de APP.
- pour faire cela, on prend des amorces sens et anti-sens (type AB-5'-HindIII et AB-3'-XhoI, donc "entourant" le gène d'intéret) contenant des sites de restrictions et on fait une PCR.
- digestion sur les sites de restriction et insertion dans un plasmide commercial également aux sites de restriction.

J'ai plusieurs questions pour cette procédure:

1) Un "template" c'est bien un gène qui sert de "porteur" au gène d'intérêt ? Enfin, c'est juste un support présentant ce gène, non ? Pourquoi ne pas tout de suite commencer avec le gène AB ?

2) Lors de la PCR, compte tenu des amorces, est-ce qu'on amplifie l'intégralité du gène APP ou juste ce qu'il y a "entre" les amorces, à savoir AB ? Pour moi, comme il y a dissociation des brin d'ADN, rien ne s'oppose à la réplication complète des deux brins... je me trompe ?

3) La découpe aux sites de restriction permet a) de récupérer le gène AB d'intérêt et b) de l'insérer dans les mêmes sites de restriction sur le plasmide commercial ?

Enfin, dernière petite question, les auteurs ne parlent absolument pas de la manière dont ils activent le gène une fois inséré. Vous avez une idée ?

D'avance merci et bonne semaine !
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[Flyingbike]

1) un template peut être n'importe quelle séquence d'ADN. Ce terme désigne ce qui sert de "base" dans une PCR, un "original" en quelque sorte.

2) regarde cette animation : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/pri...esentation.htm
tu verras qu'il y a plusieurs sortes de produit d'amplification. il y a effectivement des produits très longs mais en raison de la taille des cycles et du fait qu'ils ne sont pas majoritaires, on considère que le produit d'une PCR est un brin qui fait la taille de ce qu'il y a entre les deux amorces.

3) les sites de restriction permettent en effet que les extrémités de tes morceaux soient "cohésives". Donc on peut extraire un fragment entre certains sites, et si on choisit bien son plasmide receveur, l'insérer de facon orientée.

4) Je n'ai pas le temps de lire le papier, mais en général le plasmide contient un promoteur qui permet une expression plus ou moins forte de ce qui se trouve derrière. Ca dépend du tissu cible, de si on veut une expression constitutive ou inductible, etc...