pour ce sujet " la production de souris transgéniques par micro injection " le principe me parait simple au début , c'est juste introduire de l'ADN exogène au niveau de l’œuf avant la fusion des deux pronucléis
mais en regardant la démarche j'ai pas compris l'utilité d'une BAC et de la recombinaison homologues , des sites FRT , GFRP..plusieurs notions que je n'a pas compris
j'aime bien que quelqu'un peu m’éclaircir un peu la vision et merci
Salut,
Il y a deux types de transgénèse.
La transgénèse classique où on injecte de l'ADN dans un pronucleus (le mâle je crois). L'ADN s'insère donc de manière aléatoire dans le génome.
L'ADN injecté peut être sous forme de plasmide, ou si jamais on veut insérerer un gros morceau d'ADN, sous forme de BAC.
Quand on fait de la recombinaison homologue, on transfecte des cellules ES avec l'ADN d'intéret. Par homologie, l'ADN s'intègre à l'endroit qu'on veut dans le génome ; grâce à une sélection seules les cellules qui ont reçu le transgène au bon endroit survivent.
Puis on injecte non pas au stade pronuclei mais au stade blastocyste les cellules qui ont intégrés l'ADN.
Les FRT, c'est pas pour l'injection en elle même. C'est juste que si tu le souhaite, tu peux placer autour de ton gène d'intérêt des sites FRT. Ca permet, si tu fournis une source de flipase, d'induire une recombinaison site-spécifique et donc d'exciser le gène placé entre les séquences FRT.
C'est la même chose que le système Cre-lox : http://en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_recombination
selon notre cours le prof nous a dit " il va y avoir une cassure des deux brins de la molécule d'ADN de l’œuf pour intégrer l'ADN exogène "
donc intégration au hazard
mes questions
est ce que de l'ADN de BAC y compris le gène d’intérêt va être introduite dans l'ADN de la cellule souche ?
la recombinaison homologue va avoir lieu lors de l’intégration de l'ADN exogène dans le BAC?
C'est bien ce que j'ai dit : quand on injecte dans la cellule oeuf, c'est de la transgénèse classique : intégration au hasard.Envoyé par Biologiste-TUN
Le BAC est utilisé uniquement en transgénèse classique à ma connaissance, donc en injectant dans un pronucleus.est ce que de l'ADN de BAC y compris le gène d’intérêt va être introduite dans l'ADN de la cellule souche ?
Non.la recombinaison homologue va avoir lieu lors de l’intégration de l'ADN exogène dans le BAC?
Comme je l'ai dit, on utilise la recombinaison homologue pour de petits fragments d'ADN dans le cas de transfection de cellules ES, afin de cibler une intégration précise dans le génome.
Puis on intègre les cellules ES dans un embryon au stade blastocyste qu'on réimplante dans une souris gestante.
Une méthode d'injection de cellules ES a été publiée en 2007 dans Nature Biotechnology. L'injection se fait au stade 8 cellules, après avoir fait une ouverture dans la zone pellucide avec un laser. Cela permet d'avoir des souris homogènes en F0, contrairement à l'injection de cellules ES au stade blastocyte qui produit des souris chimères en F0, qu'il faut recroiser entre elles pour obtenir en F1 25% de souris homogènes. Si cela intéresse :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17187059
