pseudo synchronisation des cellules sans faire exprès

[invite0dfe5571]

Bonjour à tous ,

J'ai voulu comparer la prolifération cellulaire de deux lignées différentes de fibroblastes embryonnaires murins en effectuant un test d'incorporation à l'EdU (30min) (fonctionne comme BrdU), est il se trouve que pour les deux lignées, 50% des cellules sont passées par la phase S en 30 minutes, comme si elles étaient synchronisées !!! Je ne comprends pas je n'ai mis aucune drogue, et l'EdU est un analogue de la thymidine il est mis à 10mM, et j'ai lu que la thymidine (2mM) va entrainer une inhibition des ribonucleotides reductase qui transforme donc les nucletotides en ADN et par conséquent bloque les cellules en phase S. Mais 30 minutes c'est largement insuffisant. Peut être que le fait de les avoir enscemencer et trypsiner la veille peut entrainer une synchronisation ?? honnêtement je ne sais pas comment l'expliquer.
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[LXR]

As-tu un contrôle non traité par l'EdU?

[invite0dfe5571]

Oui un conttrôle où seul l'alexa fluor 488 (censée intéragir avec l'EdU) est incubé. Ces cellules sont marquées à 0%, c'est vraiment un test très spécifique. On m'a dit que les cellules en forte proliération pouvaient atteindre 30% dans un pulse de 30 min de traitement à l'EdU. Peut être que le temps qu'elles adhèrent au plastique cela fait une pseudo synchronisation et qu'elles démarent presque toutes en G1??

[LXR]

Pour savoir si l'EdU a un effet sur la répartition de tes cellules dans le cycle cellulaire (par le biais entre autre d'une synchronisation, ou un blocage en S), tu peux faire un marquage à l'iodure de propidium de tes cellules traitées et non traitées à l'EdU pour les regarder en cycle au FACS. Là au moins tu seras fixé.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0dfe5571]

Coucou,
Pardonne mon ignorance, mais je pensais que le iodure de propidium était un marqueur de cellule nécrotique. Peux tu m'expliquer le principe de l'expérience que tu me proposes ? Merci beaucoup

[LXR]

Pour faire une analyse du cycle cellulaire en FACS, tu fixes tes cellules, tu les perméabilises puis tu les colores à l'IP. Vu qu'elles sont perméabilisées, l'IP entre dans toutes les cellules, à la différence d'un test apoptose Annexin V / IP où on ne perméabilises pas les cellules exprès pour pouvoir discriminer les différents types de mort cellulaire (nécrose = IP+)

[invite0dfe5571]

D'accord merci beaucoup