Bactériologie, croissance de souches Lactocoques

[inviteaeaedfcc]

Bonjour,

Suite à un stage que j'effectue en ce moment même (Master 1 Biotch Agro), je dois mettre en place un moyen pour identifier (visualiser) et dénombrer des souches:
- Leuconostoc
- Lactococcus lactis
- Lactococcus cremoris
- Lactococcus diacteylelactis

Je n'ai quasi aucune connaissances en bactério ou microbio, ma spécialité traitant plus de la génétique...
Après avoir receuillie différentes informations sur internet,j'ai tenté d'élaborer une hypothèse pour me permettre de les différencier. Est ce que quelqu'un serait en mesure de m'aider svp ? (est-ce réalisable ? d'autres idées ?) Je suis un peu a cours d'idée cela fait 2 semaines que je cherche, que j'envoie des mails a mes profs qui me disent qu'avec le matériel dont je dispose ce n'est pas possible, et qu'il est extremement compliqué de différencier différentes souches d'une même espèce...

Je joint ci après mes idées:

J’ai trouvé sur internet l’existence d’un milieu KMK (Kempler McKAy) qui permet la croissance des bactéries aromatiques : Lc lactis, cremoris, diacetylelactis, et Ln. Il semblerait que les bactéries de type Ln et Lc diacetylelactis, poussent bleues, tandis que Lc lactis et cremoris poussent blanches. Ce milieu me permettrait de dénombrer les diacetylelactis : en effet, il est proposé de faire se développer Ln sur milieu MSE, et de soustraire cette population à la population bleue du milieu KMK. Ainsi ne resterais que le nombre souche LC diacetylelactis.

J’ai également trouvé que l’on pouvait différencier les souches Lc cremoris et lactis par leur conditions de croissance : température, pH et sel. Il semblerait que Lc Lactis puisse se développer à 40°, pH 9.2 et en présence d’une concentration en NaCl de 4%, contrairement à la souche cremoris. Ainsi je pensais faire se développer Lc lactis dans de telles conditions pour pouvoir les dénombrer.

Pour dénombrer les Lc cremoris, j’aurais fait une culture sur milieu M17 (où se développe toutes les lactocoques), pour ensuite faire une numération et soustraire de ce nombre les colonies de Lc diacteylelactis ayant poussées sur KMK, et les colonies de Lc lactis ayant poussé sur M17 en conditions spéciales (40°, pH 9.2, 4% de NaCl). Ainsi il ne me resterait que le nombre de colonies Lc cremoris.

C’est la seule solution que j’ai trouvée. N’ayant quasiment aucunes connaissances en bactériologie (en termes de techniques), je ne vois pas quel autre moyen je pourrais mettre en œuvre pour identifier et dénombrer ces souches. Qu’en pensez-vous ?

Toutefois, si cette hypothèse s’avère cohérente et réalisable, comment pourrais-je réaliser les conditions de pH 9.2 et de 4% de NaCl sur des milieux gélosés ? Pour le NaCl, j’ai trouvé sur internet qu’il était possible d’utiliser du « citrate de Na tribasique » (Na3 2H2O). Mais l’utilisation de celui-ci se fait en fonction d’une concentration : 0, 20, 40, 60 micromoles/L, ce qui ne me donne aucune idée du pourcentage de sel que cela peut représenter…

Est-ce tout de même une bonne solution que d’utiliser cette solution pour simuler des conditions saline à 4% ?

Je remercie par avance ceux qui pourront m'apporter leur aide.
Bonne journée.
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[chamouulox]

ton identification/dénombrage part d'un milieu dans lequel les 4 souches sont présentes, si j'ai bien compris?
as-tu songé aux méthodes de bio mol, style PCR quantitative? bien que proches j'imagine qu'il y a des séquences conservées ou non qui différencient tes souches?
concernant ton protocole, il me semble que le changement de milieu va biaiser ta quantification totale : d'un milieu a un autre une même souche ne pousse pas forcément pareil, si bien que retirer ce qui tu as quantifié sur un milieu de la quantification d'un autre milieu m'apparait comme peu rigoureux...

[inviteaeaedfcc]

Bonjour,

Merci pour ta réponse ! (Il s'agit bien de 4 souches présentes dans un même milieu)
Une de mes prof m'avais conseilée aussi de faire un PCR quantitative, mais je ne dispose pas du matériel nécessaire sur le site où je suis....
Pour les boites, j'en discuté également, je suis daccord avec toi sur le coté peu rigoureux du protocole, mais à défaut d'avoir trouvé mieux, je pensais essayer cela.
Sur boites de pétri, vous ne voyez aucun autre moyen de différencier différentes souches d'une meme espèce ?

[noir_ecaille]

Il y a des milieux discriminants qu'on peut utiliser pour comptabiliser plusieurs espèces à la fois en fonction des révélations par réactifs. Dans le genre on compte le milieu Heckoen et quelques autres mais c'est pour des coliformes. Il faudrait faire quelques recherches concernant vos bactéries Gam+.

Éventuellement si elles ont un équipement enzymatique différent/discriminant, on devrait pourvoir créer le milieu permettant de discriminer directement les colonies, avec tests complémentaires à la lecture si besoin.

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteaeaedfcc]

Merci pour votre réponse.
Mais cela me parait compliqué ! Je n'ai pas de connaissances réelles en bactériologie...
Je suis d'accord sur l'idée de créer un milieu de croissance sélectif, j'ai d'ailleurs déjà pus constater qu'on pouvait jouer sur les conditions salines et de pH du milieu, mais je ne connais aucun moyen de simuler ces deux paramètres sur un milieu gélosé.

[noir_ecaille]

Malheureusement je ne connais rien sur ces bactéries Il faudrait piocher sur la toile des informations sur leurs cultures, les spécificités enzymatiques ou immuno de chaque espèce et créer/trouver un protocole.

Quel milieu de culture est conseillé pour les isoler déjà ?