BIOCHIMIE: Facteur de purification maximal

[invite2a4a61ca]

Bonjour!

J'aurais besoin d'aide pour comprendre quelque chose au sujet du facteur de purification d'une enzyme.

En L2, je me souviens qu'on nous avait dit que dans un monde idéal notre but était d'atteindre:
- un rendement de 100% >>> pas de pertes de notre enzyme
sachant que Rdt = Activité Totale étape n / Activité Totale de l'extrait brut
- un facteur de purification infini >>> élimination de toutes les protéines contaminantes.
avec FP = Activité Spécifique étape n / Activité Spécifique de l'extrait brut

Je trouvais déjà peu intuitif cette idée de facteur de purification infini... mais je n'avais pas pris le temps de demander plus de précisions à notre prof et finalement je n'y ai plus pensé.

Mais cette année, après 80 heures de TP, je me suis sentie un peu perdue (et bête) quand le prof m'a posé (à peu près) cette question à l'oral: "Sachant que la béta-galactosidase représente ~4% des protéines de l’extrait brut (car elle est sur-exprimée dans la souche E.Coli 3300), quelle serait la valeur du facteur de purification si on la purifiait complètement?"


Au pif, je me souviens avoir répondu "4", sans grande conviction , et depuis je me creuse la tête pour trouver la solution... Sachant que ce genre de questions peut tomber à l'exam théorique. :/


Je sais que lors d'une purification, AS augmente mais AT pas forcément.

De plus AS = AE/mprot = AT/[prot] (car AT=AExVtot et que mprot=[prot]/Vtot)

Si j'ai 4% d'enzyme dans mon extrait brut, est-ce que ça revient à dire que j'ai une AS de 4% par rapport à une enzyme pure et donc qu'il faut que je la purifie 25 fois pour atteindre une AS maximale et donc un facteur de purification maximal?
Donc FPmax = ASmax/ASi = 100%/4% = 25 ???

(Oui je sais, une AS ce n'est pas en % mais en nkat/mg, c'est juste pour m'aider...)

Si quelqu'un pouvait éclairer ma lanterne et dissiper le brouillard de mes doutes, je lui en serais très reconnaissante...

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[invite2a4a61ca]

Ben alors, personne ne sait?

[invite2a4a61ca]

Bon, alors récemment j'ai fait une annale et là la protéine d'intérêt représentait 7% des protéines totales...
On me demande si après mes deux purifications (2 chromatos) j'ai suffisamment purifié ma protéine ou bien s'il j'ai encore besoin d'une étape supplémentaire.
Je regarde mes chiffres et j'ai un facteur de purification de 21 à peu près (ça c'est sûr).

Or 100/7=14,3~ < 21 !!!

Donc 14,3 ne peut pas être mon facteur de purification maximal, ça n'a aucun sens!
Donc ma méthode n'est pas la bonne... :/

Help! ><'

[invite2a4a61ca]

Ce qui est bien c'est qu'en fait je fais les questions et les réponses!
Mais bon, je vais quand même écrire mes conclusions, histoire que ça serve à d'autres.

Finalement j'ai revu les calculs et ma première hypothèse était la bonne, je m'étais mélangé les pinceaux et j'avais divisé AE par la masse de protéines et non la concentration en protéines, ce qui fait que mon AS, forcément, n'était pas bonne... ><'

Donc: AS (nkat/mg) = AE/[prot] = AT/mprot
(C'est là que je m'étais embrouillée, voilà pourquoi il faut toujours mettre les unités pour faire une analyse dimensionnelle ^^' )

AT = AE x Vtot

Rdt = AT(extrait purifié) / AT(extrait brut)

Fp = AS(extrait purifié) / AS(extrait brut)
et au maximum, si l'enzyme représente x% des protéines totales, Fp = 100/x

[A voir en vidéo sur Futura]